Avaliação do perfil de expressão gênica em grande escala de células indiferenciadas da polpa e de células odontoblásticas utilizando cDNA microarray

• Main Author: Maidy Rehder Wimmers Ferreira
• Other Authors: Karina Fittipaldi Bombonato Prado
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2011
• Subjects: cDNA microarray; células indiferenciadas da polpa; células odontoblásticas; expressão gênica; gene expression; odontoblastic cells; undifferentiated pulp cells
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/58/58137/tde-09062011-094759/

O extraordinário potencial regenerativo do complexo dentino-pulpar enfatiza a importância da caracterização dos processos celulares e moleculares envolvidos na regeneração dentinária. O avanço da pesquisa com células-tronco desencadeou um grande interesse de cultivá-las na presença de sinais de indução odontogênica. O objetivo do presente trabalho foi avaliar comparativamente células indiferenciadas da polpa (OD-21) e odontoblásticas (MDPC-23) através da avaliação do estímulo celular e do perfil de expressão gênica. As células OD-21 e MDPC-23 foram cultivadas em garrafas de cultura até a subconfluência e, em seguida, cultivadas em placas de 24 poços na concentração de 104 células /poço (n = 5). Os parâmetros analisados foram: (1) proliferação, viabilidade celular e atividade de fosfatase alcalina após 3, 7 e 10 dias; além de detecção e quantificação de matriz mineralizada após 17 dias (o teste estatístico utilizado foi o de Mann-Whitney para p≤0,05); (2) imunofluorescência para proteínas não-colágenas (DSPP e osteopontina) após 1, 3 e 7 dias; (3) análises de expressão transcricional através da tecnologia de cDNA microarray e PCR em tempo real. Os dados de microarrays foram analisados com o auxílio de programas de bioinformática especializados como SAM (significance analysis of microarrays), Cluster-TreeView e GeneNetwork. A expressão gênica foi avalidada pela reação em tempo real em cadeia da polimerase (PCR). Os resultados mostraram que a viabilidade celular ficou acima dos 80% em ambas as células, e que a proliferação celular e a atividade de fosfatase alcalina foram maiores nas células MDPC-23. Foram observados nódulos de mineralização somente na cultura de células odontoblásticas. A osteopontina apresentou-se igualmente presente em ambas as células, enquanto a sialofosfoproteína dentinária foi expressa em maior quantidade nas células MDPC-23. Os resultados demonstraram genes com comportamento semelhante nos dois tipos de células, tais como Bad (morte celular), Erf e Btg1 (proliferação celular), Cxcl10 e Il13 (resposta imune) e Arfgef1 (comunicação celular). Além disso, regiões no heatmap mostraram diferenças na indução e repressão de genes, como C1qb (resposta imune), Jak2 (morte, comunicação e proliferação celular), Col4a1 (adesão celular), Rpl6 e Rpl26 (processo metabólico celular). Concluímos que as células OD-21, embora indiferenciadas, compartilham muitos genes com comportamento semelhante à células odontoblásticas MDPC-23, sugerindo seu potencial para se diferenciar em odontoblastos. === The extraordinary regenerative potential of pulp-dentin complex leads to the importance of the characterization of cell and molecular processes involved in regeneration of dentin. The advancement of stem cell research sparked great interest in cultivating them in the presence of signs of odontogenic induction. The purpose of the present investigation was to evaluate comparatively undifferentiated pulp cells (OD-21) and odontoblastic cells (MDPC-23) through the assessment of cell stimulation and gene expression profiling. OD-21 and MDPC-23 cells were grown in culture flasks until subconfluence, and then cultured in 24-well plates at a concentration of 104 cells/well (n=5). The parameters analyzed were: (1) proliferation, cell viability and alkaline phosphatase activity after 3, 7 and 10 days, in addition to detection and quantification of mineralized matrix after 17 days (the statistical test used was the Mann-Whitney p≤0.05), (2) immunofluorescence for non-collagen proteins (DSPP and osteopontin) at 1, 3 and 7 days, (3) transcriptional expression analysis using cDNA microarray technology and real-time PCR. The microarray data were analyzed with the aid of specialized bioinformatics programs such as SAM (significance analysis of microarrays), Cluster, TreeView and GeneNetwork. Gene expression was avalided by real-time polymerase chain reaction (PCR). The results showed that cell viability was above 80% in both cells, and cell proliferation and alkaline phosphatase activity were higher in MDPC-23 cells. Mineralization nodules were observed only in the odontoblastic cell cultures. Osteopontin was present equally in both cells, whereas dentin sialophosphoprotein was higher expressed in MDPC-23 cells. The results showed genes with similar behavior in two cell types, such as Bad (cell death), Erf and Btg1 (cell proliferation), Il13 and Cxcl10 (immune response) and Arfgef1 (cell communication). Moreover, regions of the heatmap showed differences in induction and repression of genes, such C1qb (immune response), Jak2 (death, communication and cell proliferation), Col4a1 (cell adhesion), Rpl26 and Rpl6 (cellular metabolic process). We conclude that the OD-21 cells, although undifferentiated, share many genes with similar behavior to the odontoblastic MDPC-23 cells, suggesting their potential to differentiate into odontoblasts.