Abordagem metabolômica no estudo da exposição gestacional à poluição atmosférica

• Main Author: Andréa Tedesco Faccio
• Other Authors: Marina Franco Maggi Tavares
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2015
• Subjects: Gravidez; HILIC; Material particulado; Metabolômica; Metabolomics; Particulate matter; Pregnancy
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46136/tde-07122015-101244/

Há fortes evidências dos efeitos negativos da exposição gestacional a poluentes atmosféricos. No entanto, mecanismos de atuação de poluentes não são bem compreendidos. Alterações fisiológicas anômalas na progenitora, durante o período de gravidez, podem causar mudanças permanentes na prole, que podem desencadear futuras doenças na vida adulta. Portanto, o estudo dessas alterações maternas é importante. A metabolômica é definida como a análise global do metaboloma de um organismo em experimentos comparativos, com o objetivo de observar mudanças relativas da abundância dos metabólitos, o aparecimento ou desaparecimento de metabólitos, e pode fornecer uma melhor compreensão dos mecanismos de funcionamento celular dos organismos a nível molecular. Nesse trabalho, um estudo experimental de exposição gestacional materna, ao material particulado fino (MP2,5), foi realizado, para avaliar os efeitos dessa exposição no metabolismo, por meio da análise metabolômica global da urina de camundongos fêmeas progenitoras expostas ao MP2,5 (grupo teste) ou a ar filtrado (grupo controle) durante a gestação. Um método cromatográfico e de preparo de amostra para metabolômica urinária por HILIC-MS foram otimizados. Para a otimização da condição cromatográfica, foram investigados a influência de aditivos, concentração de sal e pH da fase móvel, bem como, a rampa do gradiente. A melhor condição foi escolhida por meio da avaliação do formato de pico, da intensidade relativa e do CV do tempo de retenção para 15 m/z selecionados, assim como, pelo número total de molecular features e CV da intensidade desses molecular features. A melhor condição obtida apresenta 20 mmol/L de formiato de amônio em sua composição do solvente B da fase móvel e 95% acetonitrila e 5% solução aquosa 400 mmol/L de formiato de amônio na composição do solvente A. Para o preparo de amostra, foram examinados diferentes solventes orgânicos e suas misturas, para a precipitação de proteínas da urina. O isopropanol foi o solvente apresentou os melhores resultados para o preparo de amostra. Dessa forma, com o método analítico otimizado, as amostras de urina de camundongos fêmeas prenhas foram submetidas à analise metabolômica global por HILIC-MS. O metaboloma dos animais foi bastante alterado pela exposição gestacional ao material particulado. Observou-se alteração dos níveis de carnitinas, aminoácidos, peptídeos, entre outros. Há também indícios de que a poluição atmosférica alterou a microbiota intestinal dos animais, devido ao aumento de N-óxido de trimetilamina, um metabólito que também é relacionado ao processo de aterosclerose. Níveis de metabólitos relacionados ao metabolismo da histidina também foram alterados devido a exposição ao MP2,5. Níveis de carnitina e acilcarnitinas foram aumentados no teste, sugerindo alteração da produção de energia na mitocontria. === There are strong evidences regarding negative effects of gestational exposure to air pollution. However, the mechanisms of action of air pollutants are not well established. Maternal anomalous physiological changes during pregnancy may cause permanent changes in offsprings, that might initiate future diseases in adult life. Therefore, the study of those maternal changes during pregnancy is important. Metabolomics is defined as the global analysis of the metabolome of an organism in comparative studies, for the measurement of relative changes in the metabolite abundance, appearance or disappearance. Metabolomics might provide a better understanding of cellular functioning at the molecular level. In this work, an experimental study of maternal gestational exposure to fine particulate matter (PM2.5) was accomplished to evaluate the effects of this exposure to the metabolism, by an untargeted metabolomics analysis of urine from pregnant mice exposed to PM2.5 or to filtered air during pregnancy. A chromatographic and sample preparation methods for urinary untargeted metabolomics analysis by HILIC-MS were optimized. For the chromatography optimization, the influence of mobile phase additives, salt concentration and pH, as well as, the gradient ramp were investigated. The best condition was chosen by the evaluation of peak shape, relative intensity and retention time CV of 15 selected m/z, as well as, the total number of molecular features and the intensity CV of those molecular features. The best condition comprises of 20 mmol/L of ammonium formate as solvent B, and 95% acetonitrile and 5% 400 mmol/L of ammonium formate as solvent A, in the composition of the mobile phase. For the sample preparation, different solvents, along with, their mixtures were examined for the urine protein precipitation. Isopropanol was the solvent that presented the best results for sample preparation. Thus, after the analytical method optimized, urine samples from the progenitors were submitted to untargeted metabolomics analysis by HILIC-MS. The animals\' metabolome were significantly changed by the gestational exposure to particulate matter. It was observed changes in the levels of carnitines, amino acids, peptides, among others. There is some indication that the air pollution has altered the gut microbiota, due to the enhancement of trimethylamine N-oxide (TMAO), a metabolite that is also related to the atherosclerosis process. The level of metabolites related to histidine metabolism were also altered due to PM2.5 exposure. Carnitine and acylcarnitine levels were also increased in the test group, suggesting an altered energy production in the mitochondria.