| Summary: | A proteína recombinante inibidora de serinoprotease denominada de Amblyomin-X foi obtida a partir de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajannense, construída e utilizada para identificar um gene que codifica um inibidor de serinoprotease do tipo Kunitz. O Amblyomin-X inibe a formação da massa tumoral in vivo, no entanto o mecanismo envolvido neste efeito não está totalmente esclarecido. Visto que um dos mecanismos anti-carcinogênicos dos inibidores de serinoproteases é a inibição do processo de angiogênese, este trabalho foi delineado para avaliar as ações do Amblyomin-X sobre a angiogênese in vivo e sobre funções da célula endotelial envolvidas neste processo. A angiogênese in vivo foi estudada em modelo de câmara dorsal por microscopia intravital. Quarenta e oito horas após a implantação da câmara dorsal, os animais receberam tratamento tópico de salina ou de Amblyomin-X por 8 dias, com intervalos de 48 horas a cada dose (10, 100 ou 1000ng/mL). Os efeitos foram avaliados em condições basais e na vigência do crescimento tumoral (injeção de 1x105 células B16-F10 de melanoma murino no tecido subcutâneo). Adicionalmente, os efeitos do Amblyomin-X sobre a permeabilidade vascular foram avaliados pela mensuração espectrofotométrica da quantidade de corante extravasado no tecido dos animais após injeção intradérmica do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) ou do Amblyomin-X. Uma série de estudos in vitro foram realizados em células endoteliais de linhagem de microcirculação (t-End) para avaliar os efeitos do Amblyomin-X (10, 100 e 1000ng/mL) sobre: 1) a migração destas células, usando modelos bidimensional (2D) de cicatrização in vitro e tridimensional (3D) em câmara de Boyden modificada, na ausência e frente ao fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF; 100 ng/mL); 2) sobre a aderência em Matrigel® e 3) sobre a secreção de prostaglandina E2 (PGE2) e a produção de óxido nítrico (NO) por ensaio imunoenzimático e reação de Griess, respectivamente. Ademais, foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X sobre a viabilidade das células B16-F10 (1x105) por citometria de fluxo. Os resultados obtidos mostram que a aplicação tópica de Amblyomin-X reduziu o número de vasos no tecido subcutâneo dorsal (10ng/mL = 21,7%; 100ng/mL= 35,7%; 1000ng/mL= 36,8% vs 1° dia de tratamento). O mesmo efeito foi observado na presença de células B16-F10 (1000ng/mL= 44,3% vs 1° dia de tratamento), além de uma redução no desenvolvimento da massa tumoral (1000ng/mL= 88% vs controle). O tratamento com Amblyomin-X reduziu a migração basal das células t-End no modelo 2D (10ng/mL=16,4%; 1OOng/mL=23, 1%; 1000ng/mL=26,8% vs controle) e 3D (10ng/mL=39,2%; 100ng/mL=49,4%; 1000ng/mL=50,4% vs controle); inibiu a adesão destas células endoteliais em Matrigel® (100ng/mL=46,4%; 1000ng/mL=48,4% vs controle); não alterou produção os mediadores químicos NO e PGE2 pelas células endoteliais; não modificou a permeabilidade vascular e não alterou a viabilidade das células de melanoma murino B16-F10. Em conjunto, os dados obtidos mostram que o Amblyomin-X inibe a formação de novos vasos em condições basais e na vigência de crescimento tumoral in vivo que este efeito pode estar relacionado à redução do desenvolvimento tumoral, uma vez que a concentração de Amblyomin-X que inibe a angiogênese não causou citotoxicidade às células tumorais in vitro. Além disso, os mecanismos envolvidos no processo de angiogênese podem ser decorrentes, pelo menos em parte, de prejuízos na migração e adesão das células endoteliais.
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The recombinant serine protease inhibitor protein called Amblyomin-X was obtained from a cDNA library of the Amblyomma cajennense salivary glands constructed and used to identify a gene encoding a kunitz type serine protease inhibitor. Amblyomin-X presents inhibitory effect on tumoral mass formation in vivo. Nevertheless, the mechanisms involved in the effects have not been clarified. Considering that interference on angiogenesis process is one of the mechanisms responsible for the antitumor activity displayed by serine protease inhibitors, this project was undertaken to study the Amblyomin-X actions on this process and on related endothelial cell functions. In vivo angiogenesis was studied using dorsal chamber model associated to intravital microscopy. Forty eight hours after dorsal chamber implantation, the animals were topically treated with saline or Amblyomin-X during 8 days, with intervals at each 48hs (10, 100 ou 1000ng/mL). The effects were evaluated at basal conditions or during tumoral development (1x105 B16-F10 murine melanoma cells injected into subcutaneous tissue). In addition, the effects of Amblyomin-X on vascular permeability were evaluated by measuring the dye leakage into dorsal intradermic tissue after local injection of vascular endothelial growth factor (VEGF) or Amblyomin-X, or both. In vitro assays were also performed using endothelial cells from microcirculation (t-End) and the effects of Amblyomin-X (10, 100 e 1000ng/mL) were studied on: 1) cell migration, using bidimensional (2D) and tridimensional (3D) models in modified Boyden chamber using chemotatic factor (VEGF100 ng/mL); 2) Matrigel® adherence and, 3) prostaglandin E2 (PGE2) and nitric oxide (NO) secretion by enzymatic assay and Griess reaction, respectively. In addition, the Amblyomin-X toxicity was evaluated on the B16-F10 cells (1x105), using flow citometry. Results obtained show that topic application of Amblyomin-X reduced the number of vessels in the subcutaneous dorsal tissue (10ng/mL = 21,7%; 100ng/mL= 35,7%; 1000ng/mL= 36,8% vs 1st day of treatment). The same effect was observed in the presence of B16-F10 cells (1000ng/mL= 44,3% vs 1st day of treatment), simultanesouly to a significant reduction on tumoral mass development (1000ng/mL= 88% vs control). Amblyomin-X treatment impaired basal migration of tEnd in the 2D (10ng/mL=16,4%; 100ng/mL=23, 1%; 1000ng/mL=26,8% vs control) and 3D model (10ng/mL=39,2%; 100ng/mL=49,4%; 1000ng/mL=50,4% vs controle); inhibited the adhesion of t-End in Matrigel® (100ng/mL=46,4%; 1000ng/mL=48,4% vs control); did not alter the production of chemical mediators (PGE2 and NO); did not modify the vascular permeability and did not affect the B16-F10 cells viability. Taken together, data here obtained show that Amblyomin-X inhibited the new vessels formation under basal conditions, and during tumoral development. The effect could be related to the reduction of tumoral progress also detected in vivo, asthe schedule of treatment employed did not induce cancer cell toxicity. The mechanisms involved in the reduced angiogenesis may be related, at least in part, to the impaired endothelial cell migration and adhesion.
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