Identificação de genes e promotores relacionados ao estresse de seca em cana-de-açúcar e obtenção de plantas transgênicas

• Main Author: Carolina Gimiliani Lembke Horta
• Other Authors: Glaucia Mendes Souza
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2013
• Subjects: Cana-de-açúcar; Promotores; Seca; Transcriptoma; Transgênicos; Drought; Promoter; Sugarcane; Trancriptome; Transgenic
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-06082013-135056/

A cana-de-açúcar possui uma característica única entre as plantas de interesse econômico mundial: a capacidade de acumular altos níveis de sacarose no colmo. No Brasil, em virtude do aumento da demanda interna e mundial por fontes energéticas renováveis, é nítida a expansão da cultura canavieira para regiões menos propícias para cultivo, como as regiões secas do centro-oeste brasileiro. O déficit hídrico é um dos principais agentes que afetam o desenvolvimento das plantas e a obtenção de variedades melhor adaptadas é fundamental para a sustentabilidade e expansão da agroindústria canavieira. Neste sentido, genes regulados por seca são alvos importantes para a obtenção de plantas transgênicas mais tolerantes ao estresse. Como a expressão constitutiva do transgene pode causar efeitos indesejáveis nas plantas transgênicas, também é necessária a identificação de promotores induzíveis pelo estímulo ambiental. O objetivo deste trabalho é a identificação de genes e sequências promotoras reguladas pela seca em cana-de-açúcar que, além de contribuir com o entendimento dos mecanismos envolvidos na tolerância ao estresse, podem ser utilizados como alvos para obtenção de plantas transgênicas mais resistentes. Para a identificação de genes diferencialmente regulados por seca, utilizamos diferentes plataformas de microarranjo: SUCAST (com 1.830 genes relacionados à transdução de sinal), SUCAMET (com 4.594 genes relacionados a metabolismo) e CaneRegNet (com sondas para a identificação de transcritos senso e antisenso que correspondem a 14.522 genes únicos). Nestas plataformas, analisamos a expressão dos genes de quatro variedades de cana-de-açúcar, duas tolerantes e duas sensíveis à seca, submetidas a 24, 72 e 120 h de déficit hídrico. Dos genes diferencialmente expressos (alguns identificados como transcritos pelas fitas senso e/ou antisenso), 53 foram selecionados para validação por PCR em tempo real. As regiões promotoras de quatro dos genes selecionados foram identificadas por meio das técnicas de andamento cromossômico, de seleção e sequenciamento de cromossomos artificiais de bactéria contendo DNA de cana-de-açúcar e de análise de contigs obtidos por Whole Genome Shotgun. Sete sequências promotoras foram selecionadas e clonadas em um vetor contendo o gene repórter gus. As atividades promotoras destas sequências foram testadas e verificadas em transformações transientes de calos embriogênicos de cana-deaçúcar. Para obtenção de plantas de cana-de-açúcar transgênicas, selecionamos o gene induzido por seca que codifica uma PP2C. Através da transformação de calos embriogênicos de cana-de- açúcar com vetor de silenciamento de pp2c, obtivemos algumas plantas com expressão de pp2c reduzida. O transcriptoma das plantas transgênicas foi avaliado. Em comparação com plantas controles e em condições normais de irrigação, identificamos 352 transcritos com expressão alterada. As plantas transgênicas com pp2c silenciado e plantas controles também foram estudadas num experimento de supressão de rega. Os dados fisiológicos e as observações morfológicas demonstraram que um dos eventos transgênicos apresentou tolerância à seca. A comparação do transcriptoma das plantas irrigadas contra as submetidas à seca e da planta tolerante contra não tolerantes ao estresse mostrou que diversos genes estavam diferencialmente regulados, inclusive aqueles envolvidos na sinalização por ABA, via no qual o gene pp2c atua. === Sugarcane has a unique characteristic among crop plants in the world: the ability to accumulate high levels of sucrose in its stems. In Brazil, due to the local and global increasing demand for renewable energy sources, it is notable the expansion of sugarcane cultivation to areas less favorable for cultivation, such as the dry regions of central-western Brazil. Water deficit is one of the main agents that affect plant development. The production of better varieties is critical to the sustainability and expansion of the sugarcane industry. In this way, genes regulated by drought are important targets for obtaining transgenic plants tolerant to stress. Since transgene constitutive expression may cause unwanted effects in transgenic plants, it is also important to identify of stress inducible promoters. The goal of this work is the identification of genes and promoters regulated by drought in sugarcane that, in addition to contributing to the understanding of the mechanisms involved in stress tolerance, can be used as targets for the production of transgenic plants more resistant to water stress. For the identification of genes differentially expressed in response to drought, we have used different microarray platforms: SUCAST (contains 1,830 genes related to signal transduction), SUCAMET (contains 4,594 genes related to metabolism) and CaneRegNet (contains probes for the identification of sense and antisense transcripts that correspond to 14,522 unique genes). In these platforms we analysed gene expression of four different sugarcane varieties, two tolerant and two sensitive to drought, after 24, 72 and 120 h of water deficit. From the genes differentially expressed (some transcribed by the sense and/or antisense strand), 53 were selected for qPCR validation. Promoter regions of four genes were identified by Chromosome Walking, selection and sequencing of BACs and the analyses of Whole Genome Sequencing contigs. Seven promoter sequences were selected and cloned into a vector containing the gus reporter gene. Promoter activity was tested and verified through the transient transformation of sugarcane embryogenic calli. For sugarcane transgenics production we selected the drought-induced pp2c gene. Through the transformation of sugarcane embryonic calli with a vector for pp2c silencing we obtained transformed plants with pp2c gene expression reduced. The transcriptome of transgenic plants was analysed. In comparison with control plants and in irrigated conditions, we identified 352 differentially expressed transcripts. Transgenic plants with silenced pp2c and control plants were studied in a pilot drought experiment. Physiological data and morphological observations indicated that one of the transgenic events presented tolerance to drought. The comparison between irrigated and drought plants and between tolerant and no tolerant showed that a large number of genes was differentially regulated including genes related to the ABA signaling, pathway in which pp2c acts.