| Summary: | Durante o processo de criopreservação o espermatozoide passa por diversas mudanças físico-químicas, podendo ocasionar variados graus de lesões as células espermáticas. Determinar o momento do processo de congelação pelo qual o espermatozoide está mais suscetível às injúrias seria importante passo para progresso do processo de congelação e, com isso, a fertilização. O objetivo foi avaliar o efeito do processo de congelação na integridade das membranas plasmática, acrossomal e potencial mitocondrial (PIAIA) integridade das membranas plasmática (MPI), acrossomal (AI), potencial mitocondrial (APM) e citoesqueleto de espermatozoides equinos in natura diluído, 5°C, -55°C e -196°C. Além de, estudar as etapas de refrigeração, congelação e dentro da congelação, a etapa de supercooling. Assim como, verificar o efeito de duas curvas de congelação (-15°C/min e -33°C/min) durante o supercooling 5°C à -55°C, para isto, foram utilizadas duas máquinas de congelação modelo TK 3000. Para desenvolvimento do experimento, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,5mL com concentrações de 100x106 espermatozoides/palheta e submetidos a uma curva 1 (rápida; -0,25°C/min de 22°C até 5°C, com período de 20 minutos para estabilização, -33°C/min de 5°C até -80°C e, -10°C/min de -80°C para -120°C) e a outra para uma curva 2 (lenta; -0,25°C/min de 22°C até 5°C, com período de 20 minutos para estabilização, -15°C/min de 5°C até -80°C e, -10°C/min de -80°C até -120°C). Para realização do experimento foram utilizados 4 garanhões com 6 repetições. Os dados obtidos dos procedimentos experimentais foram analisados com auxílio do software Statistical Analysis System for Windows SAS®, versão 9.3 (SAS, 2005). Não houve diferença estatística significativa (P>0,05) entre as duas curvas de congelação usadas. No entanto, houve efeito de tempo (P<0,05) para todas as características estudadas. Quando foi analisado progressivamente a criopreservação in natura diluído, 5°C, -55°C e -196°C, foi observado que as lesões progrediram com a congelação. Entretanto, quando estudado, as etapas do processo de congelação, a refrigeração in natura diluído até 5°C, supercooling dentro da congelação de 5°C até -55°C e congelação -55°C até -196°C, assim, o citoesqueleto sofreu maior despolimerização durante a refrigeração, entretanto, a membrana acrossomal, sofreu danos reduzidos durante esta etapa. Para MPI e APM ocorreu maior porcentagem de redução da integridade no momento final da congelação -55°C até -196°C, assim, como PIAIA influenciada pela redução de MPI e APM, sofrerem mais injúrias, nessa etapa. De uma forma geral, o processo de congelação causa danos irreversíveis ao espermatozoide equino. Sendo que, a refrigeração causou maior despolimerização do citoesqueleto, porém, praticamente não afetou o acrossomo. A redução de células com MPI, APM e PIAIA, ocorre no momento final da congelação -55°C e -196°C. O acrossomo é a membrana que menos lesa com o processo de congelação. Também, observamos similaridade entre as curvas de congelação rápida (-33°C/min) e lenta (-15°C/min), para os parâmetros estudados. Assim, este estudo permitiu avaliar progressivamente a resposta biológica do espermatozoide durante a criopreservação, obtendo um compreensão dinâmica e quantitativa, dos momentos mais críticos para o espermatozoide, para as características avaliadas e técnicas utilizadas.
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During the cryopreservation process the sperm cells undergo several physico-chemical changes, which can cause varying degrees of injury to the sperm cells. Determining the timing of the freezing process by which sperm is most susceptible to injury would be an important step in progressing the freezing process and thus fertilization. The objective was to evaluate the effect of the freezing process on the integrity of plasma membranes, acrosomal and mitochondrial potential (PIAIA) plasma membranes integrity (MPI), acrosomal (AI), mitochondrial potential (APM) and equine spermatozoa diluted in natura, 5°C, -55°C and -196°C. In addition to, study the steps of refrigeration, freezing and within freezing, the stage of supercooling. The freezing curves -15°C/min and -33°C/min during supercooling 5°C to -55°C were used to verify the effect of two freezing machines model TK 3000. For the development of the experiment, the semen was packed in 0.5mL straw with concentrations of 100x106 spermatozoa/straws and su-mitted to a curve 1 (fast; -0.25°C/min from 22°C to 5°C, with a period of 20 minutes for stabi-lization, -33°C/min from 5°C to -80°C and -10°C/min from -80°C to -120°C) and the other for a curve 2 (with a period of 20 minutes for stabilization, -15°C/min from -5°C to -80°C and -10°C/min from -80°C to -120°C). For the experiment, 4 stallions with 6 replicates were used. The data obtained from the experimental procedures were analyzed with the aid of Statistical Analysis System for Windows SAS®, version 9.3 (SAS, 2005). There was no significant statistical difference (P> 0.05) between the two freezing curves used. However, there was a time effect (P <0.05) for all the characteristics studied. When cryopreservation was progressively analyzed (semen extender, 5°C, -55°C and -196°C), it was observed that the lesions progressed with freezing. However, when studied, the steps of the freezing process, refrigeration (in natura diluted to 5°C), supercooling within freezing 5°C to -55°C and freezing -55°C to -196°C, thus, the cytoskeleton underwent greater depolymerization during refrigeration; however, the acrosomal membrane was almost not damaged during this stage. For MPI and APM, a higher percentage of integride reduction occurred at the final freezing point -55°C to -196°C, thus, as PIAIA, probably due to MPI and APM, suffered more injuries at this stage. In general, the freezing process causes irreversible damage to the equine sperm. Since, the refrigeration caused greater depolymerization of the cytoskeleton, however, it practically did not affect the acro-some. The reduction of cells with MPI, APM and PIAIA, occurs at the final moment of freezing -55°C and -196°C. The acrosome is the membrane that suffepe damages from freezing process. Also, similarities were observed between the freezing (-33°C/min) and slow (-15°C/min) freezing curves for the studied parameters. Thus, this study allowed to progressively evaluate the spermatozoid biological response during cryopreservation, obtaining a dynamic and quantita-tive understanding of the most critical mommies for the spermatozoon, for the evaluated para-meters and techniques used.
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