Transformação genética de cana de açúcar e validação de genes de referência para avaliação de número de cópias inseridas por PCR em tempo real

• Main Author: Tânia Regina Batista
• Other Authors: Helaine Carrer
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2016
• Subjects: AtDdm1; xth; Cultura de tecidos; luz LED; Transgênicos; Gene copy number; LED light; Plant tissue culture; Transgenics
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11144/tde-03102016-182202/

Atualmente a procura por produtos sustentáveis têm-se mostrado cada vez mais frequente e promissora. Em espécies de importância comercial, procura-se obter a maior produtividade possível dentro de um curto espaço de tempo aliado à preservação do meio ambiente. Dentro disso, a transformação genética de plantas se mostra uma alternativa atrativa para a geração de variedades de cana-de-açúcar que gerem produtos de maneira mais eficaz. O sucesso da transformação genética está diretamente associada a cultura de tecidos de plantas que precisa ser adequada a cada genótipo e situação de cultivo, sendo a luminosidade um dos principais fatores para a produção de plantas vigorosas. Outro fator importante é a seleção das plantas transgênicas, que precisam ser submetidas a uma quantidade de agente seletivo suficiente para identificar as plantas modificadas geneticamente. Em cana-de-açúcar, a identificação de plantas transgênicas por PCR e a definição do número de cópias é um procedimento de difícil execução e muito oneroso. Isto se dá pois no processo transformação via biolística, a inserção de genes é aleatória, produzindo plantas com variados números de cópias. Em consideração a estes fatores envolvidos na eficiência de obtenção de plantas transgênicas de cana-de-açúcar, os objetivos deste trabalho foram o aperfeiçoamento do protocolo de cultura de tecidos, transformação genética da variedade SP803280 com os genes xth, AtDdm1, como também, definir genes de referência para a quantificação do número de cópias dos genes xth e AtDdm1 inseridos na variedade SP803280 e do gene neo na RB835089, análise de ploidia e tamanho de genoma dos eventos transgênicos comparado com as plantas controle. No estudo a respeito da melhor qualidade de luz durante o cultivo in vitro na fase de regeneração de plantas, tem-se que a luz branca e a junção das luzes LED e branca se mostraram melhores para regeneração e desenvolvimento das plantas enquanto que para plântulas, as luzes LED e branca separadamente foram mais efetivas no crescimento. Para a seleção das plantas uma concentração de geneticina entre 40 e 50 mgL-1 é recomendada. As taxas de sucesso nas transformações genéticas para o gene xth variaram entre 2,5 a 18,3% dependendo do experimento e para AtDdm1 foi de 2,2% em um bombardeamento.Não houveram alterações de ploidia e tamanho do genoma nos transgênicos das duas variedades em relação à planta selvagem. Os genes p4h e prr foram identificados como os melhores para a quantificação relativa de genes inseridos por PCR em tempo real na variedade SP803280 enquanto que para a RB835089 aprt e prr se mostraram mais eficazes. A análise do número de cópias inseridas em eventos transgênicos por PCR em tempo real foi possível através das duas metodologias de cálculo testados por este trabalho, com resultados que concordam com uma tendência nesta determinação de maneira simples e rápida. === Currently the demand for sustainable products has been shown to be frequent and promising. In species of commercial importance, there is an effort to obtain the highest possible productivity in a short time, along with the environment preservation. In this context, genetic transformation of plants appears as an attractive alternative for the development of sugarcane varieties able to generate products in a more effective way. The genetic transformation success is directly associated to plant tissue culture that requires specific condition for each genotype and cultivation process, in which, luminosity is one of the main factors that determines the production of vigorous plants. Another important factor is the selection of transgenic plants, that occur by exposing plants to a sufficient amount of selective agent in order to identify only genetic modified plants. In sugarcane, identification of transgenic plants by PCR and the definition of copy numbers is a difficult procedure to implement and usually is very costly. It is because in the process of genetic transformation by biolistic, the insertion of genes occurs randomly and also produce plants with varied copy numbers. In consideration of these factors directly involved in the efficiency to obtain sugarcane transgenic plants the objectives of this study were the improvement of a tissue culture protocol, the genetic transformation of the variety SP803280 with xth and AtDdm1 genes. Also, the studies include the definition of reference genes for determining the number of copies inserted of xth and AtDdm1 genes into the variety SP803280 and neo gene in RB835089, ploidy analysis and genome size of the transgenic events compared to control plants. In the study related to the best light quality for in vitro plant regeneration, white light and the combination of LED and white lights proved to be better for plants regeneration and development while for seedlings, LED and white light separately were more effective for growth. In order to obtain selection of transgenic plants, geneticin concentration between 40 and 50 mg L-1 is recommended. Success rates in xth genetic transformation ranged from 2.5 to 18.3% depending on the experiment, and for AtDdm1 was only 2.2% in just one biolistic bombardment. There were no changes in ploidy and genome size in transgenic events related to their wild type plant. The genes p4h and prr were defined to be the best for determining the copy number of transgenic events by real time PCR in SP803280 variety, while for RB835089, the genes aprt and prr were the most effective. The analysis of the number of inserted copies was possible using the two calculation methodologies tested by this work, with results that agree with a tendency in a simple and fast quantification methodology.