Análise comparativa da PCR em tempo real, nested PCR e teste imunocromatográfico em amostras de sangue processadas em pool, como plataforma de diagnóstico molecular e sorológico de malária em larga escala

• Main Author: Giselle Fernandes Maciel de Castro Lima
• Other Authors: Sílvia Maria Fátima di Santi
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2011
• Subjects: Malária; Plasmodium/diagnóstico; Reação em cadeia da polimerase; Malaria; Plasmodium/diagnosis; Polimerase chain reaction
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5134/tde-02082011-163505/

O diagnóstico da malária tem como teste de referência a gota espessa, porém é consenso que é preciso adotar alternativas em situações específicas, com técnicas mais sensíveis e que possam ser aplicadas no processamento de grande número de amostras, como estudos clínicos, epidemiológicos ou triagem de doadores em bancos de sangue. Com a finalidade de formar uma plataforma de diagnóstico para malária em amostras agrupadas em pools, foi realizada análise comparativa da PCR em tempo real, a nested PCR e um teste rápido específico para detecção de anticorpos contra P.falciparum e P. vivax, com intuito de reduzir o número de ensaios, com custo relativamente baixo. Foram utilizadas 50 amostras de sangue positivas para Plasmodium, de acordo com a prevalência das espécies no Brasil (P. vivax 75%, P. falciparum 22% e P. malariae 3%), com diagnóstico realizado pelo método padrão ouro. Adicionalmente, 48 amostras de sangue negativas para Plasmodium foram selecionadas para controle negativo e confecção de 15 pools, contendo amostras positivas e negativas. Quatro das amostras negativas para malária eram positivas para outras doenças. Tanto as amostras positivas como as negativas foram submetidas individualmente aos ensaios de PCR em tempo real, nested PCR e teste imunocromatográfico SD Bioline Pf/Pv para detecção de malária. Um teste de PCR convencional foi incluído a fim de testar a qualidade do DNA, mediante amplificação de uma sequência do gene humano da -globina como controle interno. Posteriormente as amostras foram analisadas em pools pelos ensaios moleculares e sorológicos. Nos testes individuais, 45/49 amostras foram positivas para Plasmodium pela PCR em tempo real, com Sensibilidade de 91,84%, e Especificidade (48/48) de 100,00%; 46/49 amostras detectaram Plasmodium pela nested PCR, com Sensibilidade de 93,88%, e Especificidade (12/12) de 100,00%; 32/46 amostras foram reagentes no teste sorológico SD Bioline Pf/Pv, com Sensibilidade de 69,56%, e Especificidade (10/10) de 100,00%. Nos ensaios com amostras agrupadas, 13 pools (86,66%) foram positivos pela PCR em tempo real; a nested PCR também obteve positividade nos mesmos 13 pools (86,66%). O teste imunocromatográfico SD Bioline apresentou Sensibilidade de 73,33% considerando o diagnóstico pela gota espessa. Tanto a PCR em tempo real como a nested PCR apresentaram boa sensibilidade e especificidade, seja nas amostras clínicas analisadas individualmente ou em pools, diferentemente do teste sorológico SD Bioline. Ambas as metodologias moleculares apresentaram desempenho semelhante, com bons resultados de acurácia e indicadores de validade, como Sensibilidade, Especificidade, Valor Preditivo Positivo e Negativo. Considerando-se as vantagens inerentes à PCR em tempo real, como rapidez, processamento em sistemas fechados e dispensa de eletroforese após amplificação, este método deve ser indicado como primeira escolha para diagnóstico de malária em grande número de amostras, seguido da nested PCR para diferenciação de espécies de Plasmodium. O teste sorológico, que é específico para detecção de anticorpos contra P. vivax e P. falciparum, pode ser indicado apenas como método complementar no diagnóstico de malária === The diagnosis of malaria is based on the thick blood film as reference test, but the consensus is that it is necessary to adopt alternatives in specific situations, with more sensitive techniques that could be applied in the processing of large numbers of samples in clinical and epidemiological studies or in the screening of donors at blood banks. The purpose of this study was to analyze and compare the real-time PCR, the nested PCR and a rapid test for detection of specific antibodies against Plasmodium falciparum and P. vivax, to build a platform for malaria diagnosis in pooled samples, reducing the number of tests and providing relatively low cost. For the tests analysis, we used 50 blood samples positive for Plasmodium, according to the prevalence of the species in Brazil (75% P. vivax, 22% P. falciparum and 3% P. malariae), with diagnosis performed by the gold standard method. In addition, 48 blood samples negative for Plasmodium were selected for negative control and production of 15 pools containing positive and negative samples. Four of the malaria negative samples were positive for other diseases. Both the positive and negative samples were submitted to individual testing of real-time PCR, nested PCR and immunochromatographic test SD Bioline Pf/Pv for the detection of malaria. To check the quality of DNA, a conventional PCR was included, with amplification of a sequence of the -globin human gene as internal control. Subsequently the samples were analyzed in pools by molecular and serological tests. In individual tests, 45/49 samples were positive for Plasmodium by real time PCR, with sensitivity of 91.84% and (48/48) 100.00% specificity, 46/49 samples detected Plasmodium by nested PCR, with sensitivity of 93.88% and (12/12) specificity 100.00%; 32/46 samples were positive on serological test SD Bioline, with sensitivity of 69.56% and (10/10) 100.00% specificity. In tests with pooled samples, 13 pools (86.66%) were positive by real time PCR; the nested PCR also had positive results in the same 13 pools (86.66%). Immunochromatographic test SD Bioline Pf/Pv showed sensitivity of 73.33% compared with blood smear. Both real-time PCR and the nested PCR showed good sensitivity and specificity in samples analyzed individually and in pools, unlike the SD Bioline test. Both molecular methods showed similar performance, with good results in accuracy and validity indicators, such as sensitivity, specificity, positive and negative predictive values. Considering the advantages inherent in real-time PCR, a fast test that is processed in closed systems without post-amplification handling, this method should be indicated as first choice for diagnosis of malaria in large numbers of samples, followed by nested PCR for species determination. Serological test, that is specific for antibodies against P. vivax and P. falciparum, could be used as a supplementary method for diagnosis of malaria