Análise da comunidade fúngica associada à cana-de-açúcar e estudo da interação Trichoderma virens - planta hospedeira

• Main Author: Aline Silva Romão
• Other Authors: Welington Luiz de Araujo
• Language: Portuguese
• Published: Universidade de São Paulo 2010
• Subjects: Cana-de-açúcar; Diversidade; Fungos; Plantas hospedeiras; Plantas transgênicas; Quitina; Trichoderma.; Chitin; Diversity; Fungi; Host plants; Sugarcane; Transgenic plants
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-02082010-151201/

Fungos associados às plantas desempenham diversas funções biológicas importantes e constituem imensos reservatórios de novos compostos químicos, atividades biológicas e processos biotecnológicos ainda subexplorados. A diversidade estimada para esses microrganismos é enorme, porém menos de 7 % das espécies é conhecida. Em cana-de-açúcar, uma das principais culturas agrícolas do Brasil, estudos de interação e diversidade são recentes e ainda incipientes, principalmente com relação à comunidade fúngica e sua interação com plantas transgênicas. Uma das espécies presentes na comunidade fúngica associada à cana-de-açúcar é o fungo Trichoderma virens, o qual apresenta grande potencial de exploração como agente de controle biológico, promotor de crescimento vegetal e produtor de enzimas e metabólitos secundários. Nesse sentido, o presente trabalho buscou primeiramente determinar a estrutura e diversidade da comunidade de fungos (endófitos de raiz e rizosfera) associados a duas variedades de cana-de-açúcar, uma convencional (SP80-1842) e outra transgênica (IMI-1, expressando resistência ao herbicida imazapir), e avaliar possíveis efeitos da transgênese, do estágio de crescimento e do manejo agrícola. Além disso, uma linhagem de T. virens, isolada como endófito de raiz dessa planta, foi selecionada para estudos de interação fungo-planta e determinação dos mecanismos envolvidos na sua atividade de controle biológico. Na primeira etapa do trabalho, que compreendeu isolamento, caracterização e avaliação de alterações na comunidade fúngica, os resultados obtidos mostraram que a comunidade fúngica associada à cana-de-açúcar é formada por pelo menos 35 gêneros diferentes, a maioria do filo Ascomicota, sendo que a sua estrutura incluiu um grande número de gêneros pouco frequentes e um pequeno número de gêneros altamente frequentes (Penicillium, Fusarium, Aspergillus, Trichoderma e Epicoccum), dos quais alguns apresentam especificidade ao local de isolamento (raiz ou rizosfera). A avaliação de possíveis efeitos sobre a comunidade fúngica mostrou que a idade da planta foi o único fator que influenciou de forma significativa as características dessa comunidade, sendo que os efeitos da transgênese, se existentes, devem ser secundários quando comparados às fontes naturais de variação. Na segunda etapa, a linhagem de T. virens T.v.223 foi transformada pelo sistema Agrobacterium tumefaciens e o transformante gerado (expressando resistência à higromicina B e a proteína GFP) foi utilizado em ensaios de interação via reisolamento e microscopia. Os resultados revelaram que esse fungo não promoveu alterações fenotípicas visíveis na planta hospedeira, colonizou predominantemente as raízes, onde formou camadas densas de micélio ao seu redor, antes de penetrar o espaço intercelular das primeiras camadas de célula da epiderme do tecido radicular. Por último, mutantes de T. virens deficientes para produção de quitinases foram gerados por deleção gênica e silenciamento gênico via RNAi e avaliados quanto à capacidade de controle biológico de diferentes fitopatógenos em ensaios em casa de vegetação. Curiosamente, os resultados mostraram que as enzimas quitinolíticas podem ser essenciais à atividade de controle biológico efetuada por T. virens, mas que a importância e a participação dessas enzimas no processo dependem do tipo de planta e de patógeno envolvidos na interação, já que mais de um mecanismo deve contribuir para o controle biológico por T. virens, como por exemplo, a indução de resistência da planta. === Plant-associated fungi perform several important biological functions and are considered a vast source of novel chemical compounds, biological activities and biotechnological processes, whose potential is underexplored. The estimated diversity for these microorganisms is massive, but less than 7% of the species are already known. Sugarcane, one of the most important crops in Brazil, has only recently been studied regarding interactions and diversity, but these studies are still incipient, mainly concerning fungal community and its interaction with transgenic plants. One of the species found on sugarcane fungal community is the fungus Trichoderma virens, whose potential on biological control, growth promotion, and enzymes and secondary metabolites production is huge. Taking this into consideration, the current work aimed to determine the structure and diversity of the fungal community (root endophytes and rhizosphere) associated to two varieties of sugarcane, the conventional (SP80-1842) and the transgenic counterpart (IMI-1, expressing imazapyr herbicide resistance), and assess possible effects from transgenese, growth stage and management. In addition, a strain of T. virens, isolated as a sugarcane endophyte, was selected to perform the fungal-plant interaction assays and to determine its biological control mechanisms. The results of the first part of this work, including the isolation, characterization and evaluation of fungal community changes, showed that the sugarcane fungal community is made up by at least 35 different genera, most of them belonging to Ascomycota phylum, and its structure included many genera observed in very low frequencies, and a few genera highly frequent (Penicillium, Fusarium, Aspergillus, Trichoderma and Epicoccum), from which some have specificity to the place of isolation (root or rhizosphere). Assessing possible effects upon the fungal community showed that the growth stage was the only factor significantly influencing the communitys features, besides, if transgenese effects are present, they may be minor compared to other natural sources of variation. The second part of this work included the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of T. virens strain T.v.223 and utilization of the generated transformant (hygromycin B resistant and GFPexpressing) to perform interaction studies by re-isolation and microscopy. The results revealed that this fungus did not promote any phenotypic change in the host plant, it was found mostly in roots, formed a dense mycelia cover over the roots and was able to penetrate intercellular spaces of root epidermis first layers. Finally, T. virens chitinase-deficient mutants were generated by gene deletion and RNAi gene silencing, and tested for biological control activity against different phytopathogens in greenhouse assays. Curiously, the results showed that chitinolytic activity may be essential to the biocontrol activity of T. virens, but its significance and the input of each chitinase depends on the plant and pathogen playing the interaction, since more than one mechanism may account for T. virens biological control, for instance, the induction of plant resistance.