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Previous issue date: 2015-02-27 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES === Because biodiversity of the Amazon region and the enzyme potential of yeasts, this study aimed to select a producing yeast L-asparaginase, identify and assess the production parameters. In addition to analyzing the isolated influence of glucose in the biomass and L-asparaginase, biochemically characterize the enzymatic activity, perform pre-purification and to assess the degree of purity of the enzyme and its potential as an agent antiacrilamida. There were used 21 strains of yeasts and yeast with increased L-asparaginase activity was identified by DNA sequencing using NL-1 and NL-4 primers and used for evaluation of production parameters using two statistical planning, Plackett-Burman (PB) and Composite Central (CCD) . Glucose was evaluated by varying the concentration in the medium (0.5%, 1.0% and 5.0%) and through a factorial design 22 having as variables glucose (%) and aeration (%). A pre- purification was performed with ammonium sulfate evaluated on SDS-PAGE 12.5%. The test agent was aintiacrilamida as by inhibiting the formation of a polyacrylamide of 30% acrylamide solution. The selected yeast was identified as Tilletiopsis minor and the significant variables were presented by PB L- asparagine, yeast extract and MgSO4 , presenting 1975.67 U.mL-1 through L- aspraginase CCD 25 g.L-1 of L-asparagine, 40 g.L-1 yeast extract, 0.35 g.L-1 MgSO4 with medium adjusted to pH 5.0 at 28 °C for 72 hours. The results on the influence of glucose alone revealed that high levels of glucose decrease the production of L-asparaginase obtained with maximal activity at 1.0% glucose and aeration of 40%. The pH and optimum temperature of the enzyme was 7.0 and 50 °C respectively, and the Na+ ion with higher inhibitory effect on the L-asparaginase activity. The L-asparaginase produced showed a 7.8 purification factor in the fraction of 20-40% ammonium sulfate and 100% inhibited the formation of polyacrylamide . The electrophoretic profile showed a sharper band 80.5 kDa . The results show the Tilletiopsis minor studied as new producer of L-asparaginase source with potential for applications in the food industry. === Devido a biodiversidade da Região Amazônica e ao potencial enzimático das leveduras, o presente trabalho visou O presente trabalho buscou selecionar uma levedura produtora de L-asparaginase, identificar e avaliar os parâmetros de produção. Além de analisar a influência isolada da glicose na produção de biomassa e de L-asparaginase, caracterizar bioquimicamente a atividade enzimática, realizar pré-purificação e avaliar o grau de pureza da enzima e seu potencial como agente antiacrilamida Foram utilizadas 21 linhagens de leveduras e a levedura com maior atividade de L-asparaginase foi identificada por sequenciamento de DNA utilizando os primers NL-1 e NL-4 e utilizada para a avaliação dos parâmetros de produção através de dois planejamentos estatísticos, Plackett-Burman (PB) e Central Composto (CCD). A glicose foi avaliada variando a concentração no meio (0,5%, 1,0% e 5,0%) e através de planejamento fatorial 22 tendo como variáveis glicose (%) e aeração (%). A pré-purificação foi realizada com sulfato de amônia avaliada em SDS-PAGE 12,5%. O Teste como agente aintiacrilamida foi mediante a inibição da formação de poliacrilamida de uma solução de acrilamida a 30%. A levedura selecionada foi identificada como Tilletiopsis minor e as variáveis significativas apresentadas pelo PB foram L-asparagina, extrato de levedura e MgSO4, apresentando 1975,67 U.mL-1 de L-aspraginase através do CCD com 25 g.L-1 de L-asparagina, 40 g.L-1 de extrato de levedura, 0,35 g.L-1 de MgSO4 com meio ajustado para pH 5,0, a 28°C, durante 72 horas. Os resultados obtidos sobre a influência isolada da glicose revelaram que altos níveis de glicose diminuem a produção de L-asparaginase obtendo atividade máxima com glicose a 1,0% e aeração de 40%. O pH e temperatura ótima da enzima foi 7,0 e 50°C, respectivamente, sendo o Na+ o íon com maior efeito inibitório na atividade de L-asparaginase. A L-asparaginase produzida apresentou um fator de purificação de 7,8 na fração de 20-40% de sulfato de amônio e inibiu 100% a formação de poliacrilamida. O perfil eletroforético demonstrou uma banda mais acentuada de 80,5kDa. Os resultados obtidos evidenciam a Tilletiopsis minor estudada como nova fonte produtora de L-asparaginase.com potencial para aplicações na indústria de alimentos.
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