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Previous issue date: 2016-02-29 === The sheep and goat farming suffer great economic losses due to parasitism by gastrointestinal nematodes, reaching derail this exploration in some regions. The control of such parasites is done primarily with the use of anthelmintic drugs. The inefficiency of this type of control are the first signs of anthelmintic resistance appearance (AR), which constitutes one of the main negative and limiting factors for animal production, since it prevents the effective control of helminths in small ruminants, with adverse consequences on production rates. The anthelmintic resistance in nematodes of small ruminants for the three groups most commonly used drugs: benzimidazole (BZs) imidazotiazóis (LEV) and macrocyclic lactones (MLs) has been reported and have grown rapidly in different regions of the world. The efficient control of these parasites and the early diagnosis of anthelmintic resistance, especially in Haemonchus contortus should be recommended in order to economically viable sheep and goat breeding. Knowledge of various genetic aspects of this phenomenon can increase the shelf life of drugs currently used, and therefore try to preserve the susceptibility of parasites. This work has the objective of diagnosing anthelmintic resistance in properties of sheep and goats and to analyze the relationship with the management of the properties and identify the presence of DNA responsible for anthelmintic resistance in helminth populations of small ruminants in the state of Pernambuco. The methodological procedures were approved by the Ethics Committee on Animal Use - CEUA - UFRPE. Samples from adult specimens of H. contortus were obtained from animals naturally infected with gastrointestinal helminths belonging to properties located in the cities of the state of Pernambuco: Sairé (Agreste), Recife (Metropolitan Region), Bonito (Agreste), Moreno (Metropolitan Region) Gameleira (South Forest), Camocim de São Félix (Agreste),
Serra Talhada (Sertão). The properties of Recife and Bonito created only goats and the
others only sheep. For PCR, samples from adult specimens of H. contortus were obtained from animals naturally infected with gastrointestinal helminths, which were stored in Eppendorf tubes with PBS at 4 ° C, identified and sexed in Parasitic Diseases Laboratory of Domestic Animals - UFRPE. It was performed a pool of 20 adult males of H. contortus from each property for the extraction of DNA. The extracted DNA samples were analyzed in Parasitic Diseases Laboratory at the Federal University of Parana. PCR in order to amplify gene fragments encoding 1 isotype of β-tubulin which held the sequence of codon 200 was performed;it was also performing a PCR to identify the species of helminths collected. Both amplification reactions were performed in a thermocycler Veriti Life gradient. A sample of 20 uL of each reaction was analyzed on a 0.8% agarose gel and visualized under UV light. PCR products were purified with the commercial PureLink® Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen, USA) and sequenced by capillary electrophoresis (Sanger method) using the ABI3130 platform (Life Technologies, USA). Anthelmintic efficacy by "in vivo" method was also evaluated the by means of Fecal Egg Counting Reduction Test (FECRT) using the formula:% efficacy = [(mean OPGpre-treatment - average OPGpost-treatment) / average OPGpre-treatment)] x 100. It was detected DNA responsible for anthelmintic benzimidazole resistance (BZ) in all the evaluated properties. The percentage of anthelmintic efficacy for moxidectin presented as effective only seven days after treatment. Several management failures of control of gastrointestinal helminths were found. The results obtained confirm the anthelmintic benzimidazole resistance in H. contortus goats and sheep in the state of Pernambuco - Brazil, becoming the first record of molecular diagnosis of RA in ruminants in the State. also characterize the decline of the anthelmintic efficacy of moxidectin in herds. Both situations are favored by inadequate management practices and indiscriminate use of
chemicals for the control of gastrointestinal helminths. === A caprinovinocultura sofre grande prejuízo econômico devido ao parasitismo por nematódeos gastrintestinais, chegando a inviabilizar esta exploração em algumas regiões. O controle desse parasitismo é feito basicamente com a utilização de drogas anti-helmínticas. A ineficiência neste tipo de controle são os primeiros sinais do
aparecimento de resistência anti-helmíntica (RA), que se constitui em um dos principais fatores negativos e limitantes para a produção animal, uma vez que inviabiliza o controle efetivo da helmintose dos pequenos ruminantes, com reflexos desfavoráveis nos índices produtivos. A resistência anti-helmíntica em nematódeos de pequenos ruminantes para os três grupos de drogas mais comumente utilizados: benzimidazóis (BZs), imidazotiazóis (LEV) e lactonas macrocíclicas (LMs) vem sendo relatada e têm crescido rapidamente em diferentes regiões do mundo. O controle eficiente destes parasitos e o diagnóstico precoce da resistência anti-helmíntica, especialmente em Haemonchus contortus, devem ser preconizados a fim de viabilizar economicamente a criação de ovinos e caprinos. O conhecimento dos vários aspectos genéticos deste
fenômeno poderá aumentar a vida útil dos fármacos atualmente utilizados, e consequentemente tentar preservar a susceptibilidade dos parasitos. Neste trabalho tem-se como objetivo diagnosticar a resistência anti-helmíntica em propriedades de criação de ovinos e caprinos e analisar a relação com o manejo instituído nas propriedades e identificar a presença do DNA responsável pela resistência anti-helmíntica em populações de helmintos de pequenos ruminantes no estado de Pernambuco. Os procedimentos metodológicos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA – UFRPE. Amostras de espécimes adultos de H. contortus foram obtidas de animais naturalmente parasitados por helmintos gastrintestinais pertencentes
a propriedades localizadas nas cidades do estado de Pernambuco: Sairé (Agreste), Recife (Região Metropolitana), Bonito (Agreste), Moreno (Região Metropolitana), Gameleira (Mata Sul), Camocim de São Félix (Agreste), Serra Talhada (Sertão). Nas propriedades de Recife e Bonito criavam-se apenas caprinos e nas demais apenas ovinos. Para realização da PCR, amostras de espécimes adultos de H. contortus foram
obtidas de animais naturalmente parasitados por helmintos gastrintestinais, os quais foram estocados em tubos de eppendorf com PBS a 4ºC, identificados e sexados no Laboratório de Doenças Parasitárias dos Animais Domésticos – UFRPE. Formou-se um pool de 20 indivíduos machos adultos de H. contortus de cada propriedade, dos quais procedeu-se à extração de DNA. As amostras de DNA extraídas foram analisadas no
Laboratório de Doenças Parasitárias da Universidade Federal do Paraná. Foi realizada a PCR com o objetivo amplificar fragmentos de genes que codificam o isotipo 1 da β- tubulina que possuíam as sequências de códon 200, realizando-se também uma PCR para identificação das espécies dos helmintos coletados. As duas reações de amplificação foram conduzidas em termociclador Veriti Life com gradiente. Uma amostra de 20 μl de cada reação foi analisada sobre um gel de agarose 0,8 % e visualizada sob luz UV. Os produtos de PCR foram purificados com o kit comercial PureLink® Quick Gel Extraction (Invitrogen, USA) e sequenciados por eletroforese capilar (Método de Sanger) utilizando a plataforma ABI3130 (Life Technologies, USA).
Avaliou-se também a eficácia anti-helmíntica por método “in vivo” por meio do teste de redução do número de ovos por grama de fezes (TRCOF), usando a fórmula: % eficácia = [(média de OPGpré-tratamento - média de OPGpós-tratamento) / média de OPGprétratamento )] X 100. Detectou-se DNA responsável pela resistência anti-helmíntica aos benzimidazóis (BZ) em todas as propriedades analisadas. Os percentuais de eficácia
anti-helmíntica para a moxidectina apresentaram-se como efetivos apenas aos sete dias pós-tratamento. Diversas falhas de manejo do controle das helmintoses gastrintestinais foram encontradas. Os resultados obtidos confirmam a resistência anti-helmíntica aos benzimidazóis em H. contortus de caprinos e ovinos no estado de Pernambuco, constituindo-se no primeiro registro de diagnóstico molecular da RA em ruminantes no
Estado. Caracterizam também o declínio da efetividade anti-helmíntica da moxidectina nos rebanhos. Ambas as situações são favorecida por práticas de manejo inadequadas e uso indiscriminado de produtos químicos para o controle de helmintos gastrintestinais.
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