Avaliação fisiológica e aplicação de ddPCR (differential display PCR) em genótipos diplóides (AA) de bananeira (Musa ssp.) submetidos ao estresse salino

• Main Author: FERRAZ, Gabriela de Morais Guerra
• Other Authors: MARTINS, Luiza Suely Semen
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal Rural de Pernambuco 2017
• Subjects: Musa; Bananeira; cDNA; Estresse salino; Solo salino; RAPD; Salinity stress; Saline soils; FITOTECNIA::MELHORAMENTO VEGETAL
• Online Access: http://www.tede2.ufrpe.br:8080/tede2/handle/tede2/6302

Submitted by ([e-mail]) on 2017-02-10T14:18:44Z No. of bitstreams: 1 Gabriela de Morais Guerra Ferraz.pdf: 1062151 bytes, checksum: b0123f5d7101341f981de975826dc25b (MD5) === Made available in DSpace on 2017-02-10T14:18:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gabriela de Morais Guerra Ferraz.pdf: 1062151 bytes, checksum: b0123f5d7101341f981de975826dc25b (MD5) Previous issue date: 2008-02-29 === Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq === The Northeast of Brazil, major national producer of bananas, presents as a major limiting factor the stretch of saline soil. The urgency in the development of tolerant cultivars to salinity has led to breeding programs with the aimed to differ the bananas cultivars in diploid genotypes tolerant and sensitive, to be considered viable genetic material for pollination of triploid and tetraploid cultivars. Generally, the present study aimed to characterize diploid genotypes belonging to the AA banana genomic group on salinity and identify genes differentially expressed in contrasting genotypes. At first, this research assessed the growth and accumulation of inorganic ions in 19 diploid genotypes (AA) of bananas subjected to salt stress. The genotypes were grown in a greenhouse and submitted to irrigation with no saline water (0 mM NaCl) or with saline water (100 mM NaCl) for a period of 21 days, when the experiment was collected. To the physiological evaluation, were considered the parameters of growth:leaf area, height, number of leaves, diameter of the pseudostem, weight of the tax burden of fresh and dry, while the chemical assessment observed the concentration of sodium ions, potassium, chloride, magnesium and calcium in limbo leaf, and root pseudostem / subroot. The addition of NaCl to the cultivar solution has, in general, reduced the growth expressed by height, formation of new leaves, leaf area, diameter of the pseudostem and production of fresh and dry materials. This reduction in growth probably due to factors such as: the toxic effect of ions that have been absorbed, the low osmotic and water potential of the cells as well as the use of metabolic energy in the process of osmotic adjustment. In assessing chemical factors, it was possible to observe that the ions concentration has been preferentially presented in root tissue, showing that it is a culture moderately tolerant to salinity.The sodium and chlorine ions increased significantly with the salt increase in differentparts of the plant, while potassium suffered reduction in the leaf lamina and the pseudostem probably because it is associated to the competition with the sodium ion leading to the conclusion that the differential accumulation of ions potentially toxic (sodium and chlorine) and the maintenance of potassium, contribute to the tolerance to salinity in banana. From the physiological analysis and by means of the toxicity symptoms caused by NaCl, it was possible to observe that the effects were less intense in Birmania and Khai Nai On genotypes, than in Sowmuk, its indicates the possibility of use of this plants in programmes for cultivars improvement as tolerant and sensitive, respectively. Seven genotypes were selected for characterization by means of molecular markers RAPD, with the aim to link the physiological responses to salt stress with the formation of groups. We tested 16 random primers. The resultsshow a broad molecular genetic variability among seven genotypes studied. The formation of groups, in part is related to the data obtained in the physiological assessment, keeping in the same group the Birmania and Khai Nai On genotypes.These genotypes that showed higher tolerance to salt stress, when compared to the more salt-sensitive genotype (Showmuk), became distant genetically, so, it can be noticed the possibility of use of this molecular marker in the study of genetic diversity for this species. For the genome functional study, or transcriptoma, this study aimed the detection of possible changes in the pattern of genes expressed in the three diploid genotypes (AA) of banana, Khai Nai On, Burma and Sowmuk with contrasting results when in the absence and presence of high salt concentrations. The Differential Display PCR - ddPCR technique was used to identify and compareregions of bands from fragments of cDNA on agarose gel. A total of 43 fragments of differentially expressed cDNA was generated from the combination of four primers anchors and six random primers. Among the transcripts, 30 were once expressed by the genotype Burma and Kha Nai On, and 13 only by Sowmuk genotype. Theregions of bands with greater consistency of formation, is between 4000 bp and 150 bp. By the results of this research, it was possible to identify some fragments potentially involved to the condition of salinity in banana. The isolation, purification and sequencing of these - Expressed sequence tags - ESTs can assist in the development of new varieties of banana, more adapted to salt stress, in addition to enriching the database of public functional sequences of genomes banks. === O Nordeste do Brasil, maior produtor nacional de banana, apresenta como fator limitante a grande extensão de solos salinos. A urgência no desenvolvimento de cultivares tolerantes a salinidade tem levado programas de melhoramento genético da cultura a classificar os genótipos diplóides de bananeira em tolerantes e sensíveis, por serem considerados materiais genéticos viáveis para polinização de cultivares triplóides e tetraplóides. De modo geral, o presente trabalho buscou caracterizar genótipos diplóides pertencentes ao grupo genômico AA de bananeira quanto a salinidade além de identificar genes diferencialmente expressos nos genótipos contrastantes. Na primeira fase desta pesquisa, foi avaliado o crescimento vegetativo e o acúmulo de íons inorgânicos em 19 genótipos diplóides (AA) de bananeiras submetidas a estresse salino. Os genótipos foram cultivados em casa de vegetação e submetidos à irrigação com água não salina (0 mM de NaCl) ou águasalina (100 mM de NaCl) durante um período de 21 dias, quando foi coletado o experimento. Para a avaliação fisiológica, foram considerados os parâmetros de crescimento: área foliar, altura, nº de folhas, diâmetro do pseudocaule, peso da matéria fresca e peso da matéria seca; enquanto que a avaliação química observou a concentração dos íons sódio, potássio, cloro, magnésio e cálcio no limbo foliar, pseudocaule e raiz/rizoma. A adição de NaCl à solução de cultivo, provocou, de modo geral, redução no crescimento expresso pela altura, formação de novas folhas, área foliar, diâmetro do pseudocaule e produção de matéria fresca e seca, provavelmente devido a fatores como: o efeito tóxico dos íons que foram absorvidos; o baixo potencial osmótico e hídrico das células; bem como a utilização de energia metabólica no processo de ajustamento osmótico. Na avaliação química, foi possívelobservar que a concentração dos íons foi preferencialmente no tecido radicular, reafirmando tratar-se de uma cultura moderadamente tolerante a salinidade. Os íonssódio e cloro aumentaram significativamente frente ao incremento salino nas diferentes partes da planta, enquanto o potássio sofreu redução no limbo foliar e no pseudocaule, possivelmente por estar associado a competição com o íon sódio levando a conclusão de que o acúmulo diferencial de íons potencialmente tóxicos (sódio e cloro) e a manutenção do potássio, contribuem para a tolerância à salinidade em bananeira. A partir da análise fisiológica e por meio da sintomatologia de toxidez provocada pelo NaCl, foi possível observar que os efeitos foram menos intensos nos genótipos Birmânia e Khai Nai On, do que no Sowmuk, indicando possíveis plantas a serem utilizadas nos programas de melhoramento da cultura como tolerantes e sensível, respectivamente. Sete genótipos foram selecionados para caracterização por meio de marcadores moleculares RAPD, buscando-se relacionar as respostas fisiológicas ao estresse salino com a formação de grupos.Foram testados 16 primers randômicos. Os resultados moleculares mostram uma ampla variabilidade genética entre os sete genótipos estudados. A formação dos agrupamentos, em parte correspondeu aos dados obtidos na avaliação fisiológica, mantendo em um mesmo grupo os genótipos Birmânia e Khai Nai On. Estes genótipos que apresentaram maior tolerância ao estresse salino, quando comparados com a mais sensível ao sal (Showmuk), mostraram-se distantes geneticamente, o que vem a demonstrar a possibilidade de utilização deste marcador molecular no estudo da diversidade genética para esta espécie. Para o estudo do genoma funcional, ou transcriptoma, o presente trabalho objetivou a detecção das possíveis alterações no padrão de genes expressos nos três genótipos diplóides (AA) de bananeira, Khai Nai On, Birmânia e Sowmuk, com respostascontrastantes quando na ausência e presença de alta concentração salina. A técnica de Differential Display PCR – ddPCR foi utilizada para identificar e comparar regiões de bandas de fragmentos de cDNA em gel de agarose. Um total de 43 fragmentosde cDNA diferencialmente expressos foram gerados a partir da combinação de quatro primers âncoras e seis primers aleatórios. Dentre os transcritos, 30 foram expressos unicamente pelos genótipos Birmânia e Kha Nai On, e 13 apenas pelo genótipo Sowmuk. As regiões de bandas com maior consistência de formação, encontraram-se entre 4000 pb e 150 pb. Pelos resultados deste trabalho, foi possível identificar alguns fragmentos potencialmente envolvidos em respostas à condição de salinidade em bananeira. O isolamento, purificação e sequenciamento destes –Expressed sequence tags - ESTs poderá auxiliar no desenvolvimento de novos cultivares de bananeira, mais adaptados ao estresse salino, além de enriquecer a base de dados de bancos públicos de seqüências de genomas funcionais.