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Previous issue date: 2006-04-24 === Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq === We tested the hypothesis that heat shock and tumor necrosis factor-α (TNF-α) induce apoptosis in bovine embryos through a caspase-9 dependent mechanism.Experiment 1 determined whether the caspase-9 inhibitor, z-LEHD-fmk, blocks the apoptotic effects of heat shock and TNF-α. Embryos were collected on day 4, 5, and 6 after in vitro insemination and cultured for 24 h in the presence of either 100 μM z-LEHD-fmk reconstituted in 0.5% (v/v) DMSO or vehicle (DMSO) at either 1) 38.5°C for 24 h (control), 2) 41°C for 15 h followed by 38.5°C for 9 h (heat shock), or 3) 38.5°C for 24h with 10 ng/mL murine TNF-α. The proportion of blastomeres undergoing apoptosis was determined using TUNEL labeling. The experiment was replicated 4-5 times/day using 172-248 embryos/day. In control embryos, heat shock and TNF-α increased the proportion of cells that were TUNEL-positive as compared to embryos cultured at 38.5°C for 24 h (P<0.001). For embryos incubated with z-LEHD-fmk, in contrast, neither heat shock nor TNF-α caused an increase in TUNEL labeling (treatment x inhibitor; P<0.05). Experiment 2 tested effects of different concentrations of z-LEHDfmk on apoptotic responses of embryos to TNF-α. Embryos ³16 cells were collected on Day 6 and cultured in the presence of different concentrations of z-LEHD-fmk (0, 1 10, and 100 μM ) ± 10 ng/mL TNF-α.. After 24 h at 38.5°C, embryos were washed, fixed, and analyzed by TUNEL. The experiment was replicated 4 times (176 embryos). Addition of 10 ng/mL TNF-α increased the percentage of cells that were TUNELpositive and this increase was blocked by all concentrations of z-LEHD-fmk (TNF-α x inhibitor; P<0.05). For Exp. 3, we analyzed whether heat shock increases caspase-9 activity and whether z-LEHD-fmk blocks this increase. Embryos at the morula or early blastocyst stage were collected on day 6 and transferred to a new drop with 100 μM z- LEHD-fmk or DMSO vehicle. Embryos were then cultured at either 38.5°C for 24 h or 41°C for 15 h followed by 38.5°C for 9 h. At the end of heat shock, embryos were washed and then incubated in a caspase-9 substrate (5 μM CaspaLux 9-M1D2) at room temperature for 1 h. Caspase-9 activity was then determined by evaluation of fluorescent intensity. Embryos were classified as having low, medium or high caspase activity. The experiment was replicated 5 times using 22-26 embryos/treatment. Heat shock increased the percent of embryos classified as having medium and high caspase-9 activity and z-LEHD-fmk blocked this effect (treatment P<0.05; inhibitor P<0.001). For Exp. 4, effects of TNF-α on caspase-9 activity were evaluated. Embryos at day 6 were cultured at 38.5°C for 3, 6, 9, 12, and 15 h with 10 ng/mL TNF-α or vehicle and then caspase-9 activity was measured as described before. The experiment was replicated 8 times using 37-39 embryos/treatment. The proportion of embryos classified as having medium or high caspase activity was increased by TNF-α at all time points except 3 h (treatment P< 0.05; inhibitor P<0.01). Exp. 5 was performed to analyze the effects of heat shock and TNF-α on mitochondrial membrane integrity. Embryos at Day 3.5 were incubated at 38.5°C for 24 h + TNF-α or were incubated at 41°C for 15 h followed by 9 h at 38.5°C (heat shock). After treatment, embryos were washed and incubated in 20 nM of DiOC6 at 38.5°C for 20 min in the dark. Mitochondrial depolarization was measured by quantifying the fluorescence units/area of each embryo. Heat shock caused loss in mitochondria membrane potential (P< 0.01). However, TNF- α did not show a significant decrease on membrane polarization. The experiment was replicated 5 times (71-78 embryos/treatment). In conclusion, activation of caspase-9 dependent pathways is involved in the induction of apoptosis by heat shock and TNF-α. === Cinco experimentos foram realizados para testar a hipótese de que o estresse térmico e o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) induzem apoptose em embriões bovinos através de um mecanismo dependente da caspase-9. O experimento 1 determinou se o inibidor de caspase-9, z-LEHD-fmk, bloqueia os efeitos apoptóticos do estresse térmico e do TNF- α. Embriões foram selecionados nos dia 4, 5 e 6 após a fertilização in vitro e incubados por 24 h ± 100 μM z-LEHD-fmk reconstituído em 0.5% (v/v) DMSO ou veículo (DMSO) à 1) 38.5°C por 24 h (controle), 2) 41°C por 15 h seguido de 38.5°C por 9 h (estresse térmico), ou 3) 38.5°C por 24 h com 10 ng/mL de TNF-α. A proporção de blastômeros apoptóticos foi analisada utilizando-se a técnica de TUNEL. O experimento foi repetido 4-5 vezes utilizando 172-248 embriões por dia. Nos grupos controle o estresse térmico e o TNF-α aumentaram a proporção de células TUNEL-positivas quando comparados aos embriões incubados a 38.5°C for 24 h (P<0.001). Em contraste, embriões incubados com z-LEHD-fmk e submetidos ao estresse térmico e ao TNF-α não apresentaram aumento nas células TUNEL-positivas (tratamento x inibitor; P<0.05). O experimento 2 testou os efeitos de diferentes concentrações de z-LEHD-fmk nas respostas apoptóticas dos embriões ao TNF-α. Embiões ³16 células foram selecionados no dia 6 e incubados na presença de z-LEHD-fmk em 0, 1 10, and 100 μM ± 10 ng/mL TNF-α.. Após 24 h a 38.5°C, os embriões foram lavados, fixados e analisados por TUNEL. O experimento foi repetido 4 vezes (176 embriões). A adição de 10 ng/mL TNF-α aumentou a porcentagem de células TUNEL-positivas e este aumento foi bloqueado por todas as concentrações de z-LEHD-fmk (TNF-α x inibidor; P<0.05). No experimento 3, analisamos se o estresse térmico aumenta a atividade da caspase-9 e se o z-LEHD-fmk bloqueia este efeito. Embriões em estágio de mórula ou blastocisto inicial foram selecionados no dia 6 e transferidos para novas gotas contendo 100 μM z-LEHD-fmk ou DMSO veículo. Os embriões foram incubados a 38.5°C por 24 h ou 41°C por 15 h seguido de 38.5°C por 9 h. Ao final do estresse térmico os embriões eram lavados e incubados no substrato para caspase-9 (5 μM CaspaLux 9- M1D2) a temperatura ambiente por 1 h. A atividade da caspase-9 foi determinada avaliando-se a intensidade da fluorescência. Os embriões foram classificados apresentando baixa, média e alta atividade de caspase. O experimento foi repetido 5 vezes utilizando 22-26 embriões/tratamento. O estresse térmico aumentou a porcentagem de embriões classificados como tendo média e alta atividade de caspase-9 e z-LEHD-fmk bloqueou este efeito (tratamento P<0.05; inibidor P<0.001). Para o experimento 4 foram medidos os efeitos do TNF-α na atividade da caspase-9. Embriões no dia 6 foram incubados a 38.5°C por 3, 6, 9, 12, e 15 h com 10 ng/mL TNF-α ou veículo, analisando-se a atividade da caspase-9 foi como descirto anteriormente. O experimento foi repetido 8 vezes utilizando 37-39 embriões/tratamento. A proporção de embriões classificados como média e alta atividade de caspase aumentaram quando expostos ao TNF-α em todos os períodos de exposição, exceto 3 h (tratamento P<0.05; inibidor P<0.01). O experimento 5 foi realizado para analisar os efeitos do estresse térmico e TNF-α na integridade da membrana mitocondrial. Embriões no dia 3.5 foram incubados com + TNF-α a 38.5°C for 24 h ou a 41°C por 15 h seguido por 9 h a 38.5°C. Após os tratamemtos os embriões foram lavados e incubados em 20 nM de DiOC6 a 38.5°C por 20 min no escuro. A despolarização da mitocôndria foi mensurada por quantificação da fluorescência por unidade/área em cada embrião. O estresse térmico causou uma significativa perda no potencial da membrana mitocondrial (P<0.01). Entretanto, TNF-α não apresentou diminuição significativa. O experimento foi repetido 5 vezes (71-78 embriões/tratamento). Concluindo, o mecanismo de ativação da caspase-9 está envolvido na indução da apoptose pelo estresse térrmico e TNF-α.
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