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Previous issue date: 2015-02-27 === The optimization of xylanase production of a new Aspergillus fumigatus Fresen strain (OI-1RT)
was obtained by statistical approaches. The Plackett-Burman Design evaluation showed
that the following components of Czapeck medium were biologically significant: sodium
nitrate, potassium phosphate, magnesium sulfate and corn straw. These factors were
selected to implement the 24 Central Composite Rotational Delineation with the proposed
model validation. The response surface plots have indicated a trend for increased xylanase
activity with increasing concentrations of maize straw. An additional test was carried out with
different concentrations of maize straw and the optimized xylanase activity was 530 U ml-1 in
the presence of 6.5% (w / v) of residual biomass, which was 11 times higher than the one
obtained only with the Plackett-Burman Planning (45.8 U mL-1). The thermostability of the
enzyme was kept at 90% at 50 °C for 6 hours. Enzyma tic hydrolyses tests were performed to
obtain reducing sugars from maize straw, hydrolyzed maize straw and beechwood xylan.
This procedure has been performed for 96 hours with 2 U ml-1 for xylanase (crude extract)
and resulted in net production of 3.89, 20.96 and 21.64 μmol mL-1 for reducing sugars,
respectively. This indicated possible biotechnological applications to the crude extract with
xylan-degrading enzymes (xylanase). === As xilanases são glicosídeo hidrolases (GHs) com diferentes propriedades físico-químicas e
várias aplicações biotecnológicas, como na indústria têxtil, alimentícia e de papel e celulose.
Xilanases podem ser utilizadas para a degradação de fontes de carbono renováveis, tais
como os resíduos agroindustriais. Desta forma, é possível aproveitar a capacidade
energética de compostos disponíveis em abundância e que poderiam ser descartados
levando à poluição de solos e corpos hídricos. Atualmente, existe uma busca por estratégias
que permitam a otimização de processos biotecnológicos para utilizar a capacidade
energética presentes na biomassa para geração de produtos de valor agregado, como a
produção de xilitol e do etanol celulósico. Ferramentas bioquímico-moleculares e
planejamentos estatísticos de otimização de processos são exemplos de estratégias que
visam melhorar o desempenho catalítico de enzimas. Neste contexto, este trabalho objetivou
aproveitar resíduos agroindustriais para a indução de xilanases usando duas abordagens.
Na primeira, foi realizada a clonagem e expressão do gene xynA1 (CCNA_02894) de
Caulobacter crescentus em Escherichia coli com a obtenção de uma proteína recombinante
fusionada a uma cauda de histidina carboxi-terminal (XynA1), que foi posteriormente
purificada e caracterizada quanto a suas propriedades bioquímicas e cinéticas. Nesta
análise, verificou-se que dentre as várias fontes de carbono testadas para indução da XynA1
em C. crescentus, os substratos palha de milho, palha de milho hidrolisada e o sabugo de
milho foram os mais eficientes para induzir a atividade xilanásica. Além disso, a
caracterização da XynA pura, obtida por cromatografia de afinidade em colunas préempacotadas
de níquel-sepharose de elevado desempenho, mostrou que a XynA1 possui
atividade enzimática e atividade específica de 18,26 U mL-1 e 2,22 e U mg-1usando xilano de
beechwood como substrato na reação. A atividade de XynA1 foi inibida por EDTA e íons
metálicos tais como Cu 2+ e Mg 2+. Em contraste, ß-mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT), e Ca2+
induziram a atividade da enzima recombinante. Os dados cinéticos para XynA1 revelaram
valores de KM e Vmáx de 3,77 mg mL-1 e 10,2 μM min-1, respectivamente. Finalmente, a
enzima apresentou um pH ótimo igual a 6 e temperatura ótima de 50 °C. Além disso, 80%
da atividade de XynA1 foi mantida a 50 °C por 4 hor as de incubação. Isso sugere
estabilidade térmica para aplicação em processos biotecnológicos. Na segunda etapa do
trabalho, foi realizada a otimização da produção xilanásica por um novo isolado
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termotolerante de Aspergillus fumigatus Fresen. (OI-1R-T), obtido de bioma de Mata
Atlântica, usando metodologias estatísticas de delineamento experimental como
Planejamento Plackett-Burman (Plackett-Burman Design-PBD) e Delineamento Composto
Central Rotacional (DCCR). Verificou-se, nesses ensaios, uma atividade xilanásica de 530 U
mL-1 na presença de 6,5% de palha de milho no meio de cultivo otimizado. Ensaios de
hidrólises enzimáticas da palha de milho, palha de milho hidrolisada e do xilano de
beechwood foram realizados durante 96 horas com 2 U mL-1 de atividade xilanásica do
extrato bruto otimizado no mesmo resíduo, resultando em uma produção líquida de 3,89,
20,96 e 21,64 μmol mL-1 de açúcares redutores, respectivamente. Assim, sugere-se que a
enzima fúngica, mesmo em extrato bruto, também poderia ser aplicada em processos
biotecnológicos diversos.
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