Aproveitamento de resíduos agroindustriais para indução dexilanases: clonagem e expressão do gene xyna1 de caulobacter crescentus e produção enzimática por delineamento experimental em aspergillus fumigatus fresen

• Main Author: Graciano, Luciana
• Other Authors: Simão, Rita de Cássia Garcia
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Estadual do Oeste do Parana 2017
• Subjects: xilanase; resíduos agroindustriais; clonagem; expressão; otimização; Caulobacter crescentus; Aspergillus fumigatus; xylanase; experimental design; maize straw; enzymatic hydrolysis; CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::ENGENHARIA AGRICOLA
• Online Access: http://tede.unioeste.br:8080/tede/handle/tede/225

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:47:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciana_ Graciano.pdf: 1359694 bytes, checksum: 9321745e3e0faea5a21d91af3579b01a (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 === The optimization of xylanase production of a new Aspergillus fumigatus Fresen strain (OI-1RT) was obtained by statistical approaches. The Plackett-Burman Design evaluation showed that the following components of Czapeck medium were biologically significant: sodium nitrate, potassium phosphate, magnesium sulfate and corn straw. These factors were selected to implement the 24 Central Composite Rotational Delineation with the proposed model validation. The response surface plots have indicated a trend for increased xylanase activity with increasing concentrations of maize straw. An additional test was carried out with different concentrations of maize straw and the optimized xylanase activity was 530 U ml-1 in the presence of 6.5% (w / v) of residual biomass, which was 11 times higher than the one obtained only with the Plackett-Burman Planning (45.8 U mL-1). The thermostability of the enzyme was kept at 90% at 50 °C for 6 hours. Enzyma tic hydrolyses tests were performed to obtain reducing sugars from maize straw, hydrolyzed maize straw and beechwood xylan. This procedure has been performed for 96 hours with 2 U ml-1 for xylanase (crude extract) and resulted in net production of 3.89, 20.96 and 21.64 μmol mL-1 for reducing sugars, respectively. This indicated possible biotechnological applications to the crude extract with xylan-degrading enzymes (xylanase). === As xilanases são glicosídeo hidrolases (GHs) com diferentes propriedades físico-químicas e várias aplicações biotecnológicas, como na indústria têxtil, alimentícia e de papel e celulose. Xilanases podem ser utilizadas para a degradação de fontes de carbono renováveis, tais como os resíduos agroindustriais. Desta forma, é possível aproveitar a capacidade energética de compostos disponíveis em abundância e que poderiam ser descartados levando à poluição de solos e corpos hídricos. Atualmente, existe uma busca por estratégias que permitam a otimização de processos biotecnológicos para utilizar a capacidade energética presentes na biomassa para geração de produtos de valor agregado, como a produção de xilitol e do etanol celulósico. Ferramentas bioquímico-moleculares e planejamentos estatísticos de otimização de processos são exemplos de estratégias que visam melhorar o desempenho catalítico de enzimas. Neste contexto, este trabalho objetivou aproveitar resíduos agroindustriais para a indução de xilanases usando duas abordagens. Na primeira, foi realizada a clonagem e expressão do gene xynA1 (CCNA_02894) de Caulobacter crescentus em Escherichia coli com a obtenção de uma proteína recombinante fusionada a uma cauda de histidina carboxi-terminal (XynA1), que foi posteriormente purificada e caracterizada quanto a suas propriedades bioquímicas e cinéticas. Nesta análise, verificou-se que dentre as várias fontes de carbono testadas para indução da XynA1 em C. crescentus, os substratos palha de milho, palha de milho hidrolisada e o sabugo de milho foram os mais eficientes para induzir a atividade xilanásica. Além disso, a caracterização da XynA pura, obtida por cromatografia de afinidade em colunas préempacotadas de níquel-sepharose de elevado desempenho, mostrou que a XynA1 possui atividade enzimática e atividade específica de 18,26 U mL-1 e 2,22 e U mg-1usando xilano de beechwood como substrato na reação. A atividade de XynA1 foi inibida por EDTA e íons metálicos tais como Cu 2+ e Mg 2+. Em contraste, ß-mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT), e Ca2+ induziram a atividade da enzima recombinante. Os dados cinéticos para XynA1 revelaram valores de KM e Vmáx de 3,77 mg mL-1 e 10,2 μM min-1, respectivamente. Finalmente, a enzima apresentou um pH ótimo igual a 6 e temperatura ótima de 50 °C. Além disso, 80% da atividade de XynA1 foi mantida a 50 °C por 4 hor as de incubação. Isso sugere estabilidade térmica para aplicação em processos biotecnológicos. Na segunda etapa do trabalho, foi realizada a otimização da produção xilanásica por um novo isolado vii termotolerante de Aspergillus fumigatus Fresen. (OI-1R-T), obtido de bioma de Mata Atlântica, usando metodologias estatísticas de delineamento experimental como Planejamento Plackett-Burman (Plackett-Burman Design-PBD) e Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR). Verificou-se, nesses ensaios, uma atividade xilanásica de 530 U mL-1 na presença de 6,5% de palha de milho no meio de cultivo otimizado. Ensaios de hidrólises enzimáticas da palha de milho, palha de milho hidrolisada e do xilano de beechwood foram realizados durante 96 horas com 2 U mL-1 de atividade xilanásica do extrato bruto otimizado no mesmo resíduo, resultando em uma produção líquida de 3,89, 20,96 e 21,64 μmol mL-1 de açúcares redutores, respectivamente. Assim, sugere-se que a enzima fúngica, mesmo em extrato bruto, também poderia ser aplicada em processos biotecnológicos diversos.