Amplificação, clonagem e expressão de proteína recombinante do vírus da doença de Aujeszky em sistema de baculovírus para utilização em programa de controle e erradicação

• Main Author: Dambros, Régia Maria Feltrin
• Other Authors: Zanella, Janice Reis Ciacci
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade do Estado de Santa Catarina 2016
• Subjects: Suíno - Doeças; DNA recombinante; Engenharia genética; Swine - Diseases; Recombinant DNA; Genetic engineering; CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::MEDICINA VETERINARIA::MEDICINA VETERINARIA PREVENTIVA::DOENCAS INFECCIOSAS DE ANIMAIS
• Online Access: http://tede.udesc.br/handle/handle/966

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCV06MA014.pdf: 2536288 bytes, checksum: 2ced4e5eb18884533f8a66a86da4f665 (MD5) Previous issue date: 2006-07-04 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior === Aujeszky s disease (AD) is an infect-contagious illness that causes serious economical damages to the producer and the swine industry. Aiming to develop mechanisms and to improve technologies that are faster, more sensitive and more specific for diagnosis and for use in free areas or in AD s eradication programs, the sequence codifier of the glycoprotein E (gE) of Aujeszky s disease virus (ADV) was amplified, cloned and expressed. Through genetic engineering the sequence of the gE gene was propagated in an host organism. The gE was amplified by the technique of polimerase chain reaction (PCR), cloned in the vector pGem®-T Easy and transformed in competent cells of Escherichia coli, DH-5a . The clone obtained was sub-cloned in the expression plasmid pFastBac 1, which contains the promoter gene of the polyhedrin. The obtained subclone was analyzed inside for certification of its correct plasmid orientation with the restriction endonucleases BamH I and EcoR I. The sub-clone with the correct orientation had its DNA extracted and used for transposition inside the bacmid (recombinant baculovirus and helper plasmid with competent DH10Bac cell). Colonies with inserted gE were selected by the phenotype of the colony, which expresses white color when cloned. White recombinant colonies had their DNA extracted and used for cotransfection in insect cells Trichoplusia ni (BTI-Tn5B1-4). The recombinant-gE baculovirus was inoculated in cultured cells and expressed the recombinant gE by PCR and Western blotting . The recombinant-gE baculovirus containing only the gE gene of the VDA will be used for antigen and monoclonal antibodies production, which will aid in the development of a more sensitive, specific and safer for the use in VDA free regions === A doença de Aujeszky (DA) é uma enfermidade infecto-contagiosa que causa graves prejuízos econômicos ao produtor e à agroindústria suinícola. Com o objetivo de desenvolver insumos e aprimorar tecnologias que sejam mais rápidas, sensíveis e específicas de diagnóstico para uso em regiões livres ou em erradicação da DA, a seqüência codificadora da glicoproteína E (gE) do vírus da doença de Aujeszky (VDA) foi amplificada, clonada e expressada. Através da engenharia genética a seqüência do gene da gE foi propagada em um organismo hospedeiro. A gE foi amplificada pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) , clonada no vetor pGem®-T Easy e transformada em células competentes de Escherichia coli, DH-5a . O clone obtido foi subclonado no plasmídeo de expressão pFastBac 1, o qual possui o sítio promotor do gene da poliedrina. O subclone obtido foi analisado para certificação de sua orientação correta dentro do plasmídeo com as endonucleases de restrição BamH I e EcoR I. O subclone com a orientação correta teve seu DNA extraído e usado para a transposição dentro do bacmid (baculovírus recombinante e plasmídeo helper em célula competente DH10Bac ). As colônias com inserto gE foram selecionadas pelo fenótipo da colônia, a qual expressa cor branca quando clonada. As colônias brancas recombinantes tiveram seu DNA extraído e usado para a co-transfecção em células do inseto Trichoplusia ni (BTITn5B1- 4). O baculovírus gE-recombinante ao ser inoculado em cultivo celular, expressou a gE recombinante, comprovada pela técnica de PCR e Western blotting . O baculovírus gE-recombinante contendo apenas o gene da gE do VDA será utilizado para produção de antígeno e de anticorpos monoclonais, o que auxiliará no desenvolvimento de um teste de diagnóstico mais sensível, específico e mais seguro para uso em áreas livres do VDA