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Previous issue date: 2012-02-24 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior === The viability evaluation of animal cells subjected to different cryopreservation strategies is
important for studies in cell culture, application in animal cloning and the establishment and
maintenance of gene banks. The aim of this study is optimize a method for cryopreservation
of bovine somatic cells in different containers using different cryoprotectants. For this
purpose, three experiments were conducted using bovine skin fibroblast cells obtained by ear
biopsy explantation by ear biopsy of a female Flemish breed. In the first experiment the cells
were cryopreserved in cryotubes at fixed concentration of 1x106 cells/mL and in three
freezing culture medium (1) culture medium +10% DMSO, (2) culture medium + 10%
propylene glycol, (3) culture medium + 10% ethylene glycol. In the second experiment the
freezing was performed with the same solutions used in experiment 1, however, the cells were
cryopreserved in 0.25 mL and 0.5 mL straws. In the third experiment cells in different
concentrations, (0.33x106 cells/mL, 1x106 cells/mL, 3x106 cells/mL and 5x106 cells/mL) were
cryopreserved in 0.5 mL straws with culture medium + 10% propylene glycol. In all
experiments, the cells were thawed in waterbath at 37 oC for evaluation of cell survival by
trypan blue method and by the cell growth curve after 72 h in culture, moreover, in the first
experiment was carried out the population doubling time test (PDT). The data were analyzed
by analysis of variance with pairwise comparisons between groups by the Tukey test, with
significance level of 5%. In first experiment there was no significant difference between
groups using different cryoprotectants and the time of cell division, estimated by PDT, ranged
from 15.9 to 16.5 hours.In the second experiment no significant difference in the survival rate
between groups was observed, regardless of the cryoprotectant used, and considering the 0.25
and 0.5 mL straws. In the growth curve, the survival performance of cells cryopreserved in
0.25 ml straws was statistically inferior to that frozen in 0.5 mL straws and cryovials. In this
experiment all groups had significantly lower survival results campared to the control group.
In the third experiment, the cell concentrations that presented a better survival rate after
thawing were 0.33x106cells/ mL and 1x106 cells /mL. Based on the results obtained it follows
that straws can be used for freezing cells and the straws of 0.5 mL showed results consistent
with those obtained by cryotubes. Likewise the use of PG can be a viable alternative for the
freezing somatic cells === A avaliação da viabilidade de células animais submetidas à criopreservação é importante para
estudos em cultivo celular, aplicação em clonagem animal e para o estabelecimento e
manutenção de bancos genéticos. O objetivo do trabalho é otimizar uma metodologia de
criopreservação de células somáticas bovinas utilizando diferentes recipientes e
crioprotetores. Para tanto, três experimentos foram conduzidos utilizando células
fibroblásticas de origem cutânea foram obtidas por meio de biópsia auricular de uma fêmea da
raça Flamenga. No primeiro experimento, as células foram criopreservadas em criotubos na
concentração fixa de 1x106 células/mL em três soluções de congelamento (1) meio de cultivo
+10% de DMSO; (2) meio de cultivo + 10% de Propileno glicol; (3) meio de cultivo + 10%
de Etileno glicol. No segundo experimento, o congelamento foi realizado com as mesmas
soluções crioprotetoras utilizadas no experimento um, porém as células foram criopreservadas
em palhetas de 0,25 mL e 0,5 mL. No terceiro experimento, foram testadas diferentes
concentrações celulares, (0,33x106 cel/mL, 1x106 cel/mL, 3x106 cel/mL e 5x106 cel/mL) que
foram criopreservadas em palheta de 0,5 mL utilizando-se meio de cultivo + 10% propileno
glicol. Em todos os experimentos, as células foram descongeladas em banho maria a 37 oC
para avaliação da sobrevivência celular pelo método de azul de Tripan e avaliação da curva de
crescimento celular após 72 h de cultivo, além disso, no primeiro experimento foi realizado o
teste de population doubling time (PDT) e no segundo e terceiro experimento o grupo
controle foi realizado com células criopreservadas em criotubo utilizando a solução de
congelamento composta meio de cultivo +10% de DMSO. Os dados foram analisados através
da análise de variância com comparações pareadas entre grupos pelo teste de Tukey, com
nível de significância de 5%. No primeiro experimento, não houve diferença significativa
entre os grupos utilizando diferentes crioprotetores e o tempo de divisão celular estimado pelo
PDT variou de 15,9 a 16,5 horas. No segundo experimento, a taxa de sobrevivência pós
descongelamento, considerando as palhetas de 0,25 e 0,5 mL, não apresentou diferença
significativa entre os grupos, independente do crioprotetor utilizado. Já na curva de
crescimento, a sobrevivência das células criopreservadas em palhetas de 0,25 mL apresentou
um desempenho estatisticamente inferior às congeladas em palhetas de 0,5 mL e criotubos.
Neste experimento todos os grupos apresentaram resultados de sobrevivência
significativamente inferiores ao grupo controle. No terceiro experimento as concentrações
celulares que apresentaram melhores resultados de sobrevivência após o descongelamento
foram de 0,33x106 cel/mL e 1x106 cel/mL. Com base nos resultados obtidos conclui-se que é
possível utilizar palhetas para o congelamento de células e que as palhetas de 0,5 mL
apresentaram resultados compatíveis aos obtidos com criotubos. Da mesma forma o uso de
PG pode ser uma alternativa viável para o congelamento de células somáticas
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