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Previous issue date: 2009-09-24 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES === It was been demonstrated that curine and reticuline, induced a vasodilator effect in
the rat small mesenteric arteries through inhibition of voltage-gated Ca2+ channels
(VGCC). These compounds, curine and reticuline were isolated from the root barks of
Chondrondendron platyphyllum and Ocotea duckei Vattimo, respectively, therefore
the aim of this work was to evaluate the vasodilator mechanism of curine and
reticuline, bisbenzylisoquinoline alkaloids (BBA), isolated from the root barks of
Chondrondendron platyphyllum and Ocotea duckei Vattimo, respectively, using
functional and molecular approaches.
Tension measurements in aorta rings, whole-cell patch-clamp and confocal
techniques were employed to study the action of these alkaloids. The A7r5 smooth
muscle derived cell line was used for Ca2+ currents measuring and the intracellular
calcium concentration ([Ca2+]i) were evaluated using confocal microscopy. The main
results are as follows: in aortic rings, curine (3 - 300 μM) antagonized KCl (60 mM)
and Bay K8644 (3 x 10-7 M) induced contractions. In whole-cell configuration, curine
reduced the voltage-activated peak amplitude of ICa,L in a concentration-dependent
manner. However, the Ca+2 current density versus voltage relationship and maximal
activation voltage of ICa,L were not changed. Moreover curine did not also affect the
steady-state activation of ICa,L, but shifted the steady-state inactivation curve of
ICa,L for more negative potentials, however this effect was not changed in the
presence of IBMX, dbcAMP and 8-brcGMP, suggesting that cyclic mononucleotides,
such as cAMP and cGMP, are not involved in curine effect. In confocal experiments,
curine inhibited the rise on the [Ca2+]i induced by KCl (60 mM) in dispersed vascular
smooth muscle cells. In reference to reticuline (3 300 μM) was verified that alkaloid
agonized CaCl2 and KCl-induced contractions and elicited vasorelaxation in aortic
rings. In whole-cell configuration, reticuline reduced the voltage-activated peak
amplitude of ICa,L in a concentration-dependent manner, but did not change the
characteristics of current density versus. voltage relationship. Reticuline shifted
leftwards the steady-state inactivation curve of ICa,L, however this effect was not
changed after application of dibutyryl cyclic adenosine monophosphate to the cell. In
cells pretreated with forskolin, an adenylate cyclase activator, the addition of
reticuline caused further inhibition of the Ca2+ currents suggesting an additive effect,
indicating that cyclic mononucleotides were not involved.
Taken together the results have shown that curine and reticuline elicits
vasorelaxation due to the blockade of the L-type voltage-dependent Ca2+ current in
rat aorta smooth muscle cells. The reported effect may contribute to the potential
cardioprotective efficacy of curine and reticuline. === Curina e reticulina são alcalóides isolados das cascas do caule e raízes de
Chondrondendron platyphyllum e de Ocotea duckei Vattimo, respectivamente.
Estudos anteriores demonstraram que esses alcalóides são capazes de induzir
efeito vasodilatador em artéria mesentérica e aorta de rato, respectivamente, devido
possível inibição dos canais para Ca2+ dependentes de voltagem (VGCC). O objetivo
deste trabalho foi investigar o mecanismo vasodilatador de curina e reticulina
realizando experimentações funcionais e moleculares. Foram utilizadas medidas de
tensão em anéis de aorta de rato, e empregadas técnicas de patch-clamp e de
microscopia confocal para estudos da ação desses alcalóides. Também foram
utilizadas células A7r5, uma linhagem de células musculares lisas embrionária
derivada de aorta torácica de rato, que foram usadas para medir as correntes de
Ca2+ macroscópicas e a concentração de cálcio intracelular ([Ca2+]i), que foram
avaliadas usando a técnicas de patch-clamp e microscopia confocal,
respectivamente. Os principais resultados são: em anéis de aorta, curina (3 - 300
μM) antagonizou as contrações induzidas por KCl (60 mM) e Bay K8644 (3 x 10-7 M).
Na configuração whole-cell patch clamp , curina reduziu a amplitude da corrente de
cálcio do tipo L (ICa,L) de maneira dependente de concentração. Porém, curina não
alterou as características das correntes na relação corrente-voltagem. A voltagem de
ativação máxima para ICa,L não foi diferente em relação ao controle. Além disso,
curina também não afetou a ativação no estado estacionário das ICa,L, mas deslocou
a curva da inativação estacionária para potenciais mais negativos. No entanto, esse
efeito promovido por curina não foi alterado na presença de IBMX, dbcAMP e 8-
brcGMP, sugerindo que os mononucleotídeos cíclicos, como APMc e GMPc, não
estão envolvidos no efeito da curina. Em experimentos com microscopia confocal
curina inibiu os transientes de cálcio intracelulares, e reduziu o aumento de [Ca2+]i
induzidos por KCl (60 mM) em células de músculo liso vascular. Em relação à
reticulina (3 300 μM), foi verificado que esse alcalóide antagonizou as contrações
induzidas por CaCl2 e KCl, provocando vasorelaxamento em anéis de aorta. Na
configuração whole-cell patch clamp , reticulina também reduziu a amplitude das
ICa,L de maneira dependente de concentração, mas não mudou as características
da corrente na relação corrente-voltagem. A reticulina deslocou para potenciais mais
negativos a curva de inativação estacionária para as ICa,L. Porém, esse efeito não
foi alterado após a aplicação de dbcAMP e 8-brcGMP. Em células pré-tradadas com
forskolina, um ativador da adenilil ciclase, a adição da reticulina causou uma inibição
adicional das correntes de Ca2+ que sugere um efeito aditivo da reticulina, indicando
que os mononucleotídeos cíclicos não estão envolvidos. Dessa forma, curina e
reticulina provocaram vasorelaxamento, devido ao bloqueio das correntes de Ca2+
dependentes de voltagem do tipo-L em células de músculo liso, em cultura e recémdispersas,
de aorta de rato, revelando que esses alcalóides têm um importante
potencial como modelo químico para a concepção e posterior desenvolvimento de
novos fármacos com propriedade protetora cardiovascular.
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