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Previous issue date: 2010-12-21 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES === Streptococcus mutans is the main etiologic agent of dental caries, especially due
to its ability to adhesion to the tooth surface. This bacterium produces
glycosyltransferases that synthesize polymers of soluble and insoluble glucan from
sucrose, which increases the colonization of cariogenic bacteria and promote the
formation of biofilm on the surface of the teeth. Chlorhexidine is the most frequent
topical antibiotic used in dentistry and is considered standard in the various dental
specialties, but there are few studies on this drug at the molecular level. The aim of the
present study was to investigate the antibacterial activity of chlorhexidine gluconate
against in vitro planktonic and biofilm Streptococcus mutans cells in a dose- and timedependent
manner. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum
bactericidal concentration (MBC) of chlorhexidine in planktonic cells and MBC in
biofilms were determined by microdilution method. Total S. mutans RNA from either
planktonic cells or biofilms exposed or non-exposed (controls) to chlorhexidine were
extracted, purified and reversely transcribed to cDNA. Real-time reverse transcription-
PCR was used to quantify the relative levels of 16S rRNA, gtfB, gtfC and gtfD
transcription of S. mutans in the presence of CHX. The activity of CHX in the initial
biofilm structure for 2 and 4 h and morphological alterations in planktonic cells, under a
range of CHX concentrations, was examined by Scanning Electron Microscopy (SEM).
CLX MIC and MBC for planktonic cells were 2.2 mg/L and 18 mg/L, respectively,
while MBC for biofilm was 800 mg/L. Planktonic cells exposed to CLX 4.5 mg/L and 9
mg/L were reduced almost by 6- and 20-fold, whereas biofilm counts were reduced
(2.5-fold or more) in concentrations above 500 mg/L. In planktonic cells, exposition to
CHX 4.5 mg/L increased gtfC and gtfD expression by 11-fold and 4-fold (p<0.01),
respectively. In biofilm, expression of gtfB, gtfC and gtfD were reduced (<1.6-fold
p<0.01) at concentrations above 500mg/L. Cell surfaces did not show any change when
planktonic cells were exposed to CHX at 4.5 mg/L for 2 or 4h, but after 6 h, several
wilted S. mutans cells with lost intracellular material could be observed. A decrease in
the cells chain length and matrix was found when the initial biofilm was exposed from
1.1 mg/L to 4.5 mg/L of CHX, while 1200 mg/L and 2000 mg/L caused extensive
precipitation of unknown material on the slide. Thus, we conclude that the CHX effects
against bacteria depend on the kind of growth organization and the concentration/time
of exposure to the drug. CHX may affect cell walls and intervene with mechanisms of
the biofilm formation, and at sub-lethal concentrations, affect the expression of gtfs,
which may exert an anticariogenic effect. === Streptococcus mutans é o principal agente etiológico da cárie dentária,
especialmente devido à sua habilidade de adesão à superfície dentária. Esta bactéria
produz glicosiltransferases, que sintetizam polímeros de glicano solúveis e insolúveis a
partir da sacarose, que aumentam a colonização de bactérias cariogênicas e promovem a
formação de biofilme dental na superfície dos dentes. A clorexidina é o antimicrobiano
tópico mais utilizado na Odontologia, sendo considerado padrão nas diversas
especialidades odontológicas, porém existem poucos estudos com esta droga em nível
molecular. O objetivo do presente estudo foi investigar a atividade do gluconato de
clorexidina em Streptococcus mutans UA159, plantônicos e organizados em biofilme,
em diferentes concentrações e períodos de crescimento. A Concentração Inibitória
Mínima (MIC) e a Concentração Bactericida Mínima (MBC) da clorexidina nas células
plantônicas e MBC em biofilmes, foram determinadas pelo método da microdiluição. O
RNA total das S. mutans plantônicos e organizados em biofilme, expostos ou não
(controles) à clorexidina foram extraídos, purificados e reversamente transcritos a Cdna.
O PCR quantitativo em tempo real foi utilizado para quantificar os níveis relativos de
transcrição dos genes 16S rRNA, gtfB, gtfC e gtfD de S. mutans na presença ou ausência
de clorexidina. A atividade da clorexidina na estrutura do biofilme inicial de 2 e 4h, e as
alterações morfológicas nas células plantônicas, sobre concentrações variadas, foi
examinada por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A MIC e a MBC para
células plantônicas foram 2,2 mg/L e 18 mg/L, respectivamente, e a MBC para os
biofilmes foi de 800 mg/. A exposição à clorexidina, nas concentrações de 4,5 mg/L e 9
mg/L, reduziu a contagem das células plantônicas por 6 e 20 vezes, respectivamente,
enquanto a contagem das células do biofilme foram reduzidas (2,5 vezes ou mais) em
concentrações acima de 500 mg/L. Nas células plantônicas, a exposição a 4.5 mg/L de
CHX, aumentou a expressão das gtfC e gtfD por 11 e 4 vezes (p<0.01),
respectivamente. Em biofilme, a expressão das gtfB, gtfC e gtfD foram reduzidas (<1,6
x, p<0.01) em concentrações acima de 500 mg/L. As superficies celulares
aparentemente não mostraram modificação quando as células plantônicas foram
expostas às concentrações de 4,5 mg/L por 2 ou 4h, mas depois de 6h, várias células
murchas de S. mutans com material intracelular extravasado, foram observadas. Um
decréscimo no comprimento das cadeias das células e também da matriz foram
encontradas quando os biofilmes iniciais foram expostos a 1,1 mg/L e 4,5 mg/L de
clorexidina, enquanto as concentrações de 1200 mg/L e 2000 mg/L causaram extensa
precipitação de material desconhecido nas lamínulas. Assim, concluiu-se que os efeitos
da clorexidina contra S. mutans dependem do tipo de organização celular, período de
crescimento e concentração utilizada da droga. A clorexidina pode afetar a parece
celular e interferir com mecanismos de formação do biofilme e, em concentrações
subletais, reduz a expressão de algumas gtfs, o que pode exercer um efeito
anticariogênico.
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