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Previous issue date: 2009 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) === Associação Fundo de Incentivo à Psicofarmacologia (AFIP) === Introdução: Transplante alogênico de células tronco hematopoéticas (TCTH) é uma
importante terapia para doenças hematológicas, mas o sucesso de uma porção de
transplantes é limitado pela doença do enxerto versus hospedeiro(GVHD). Os fatores
de risco conhecidos para GVHD agudo (aGVHD) não fornecem uma estimativa precisa
do risco individual e não auxiliam na individualização da terapia. Até o momento, não
existe método diagnóstico que permita predizer aGVHD. A identificação de pacientes
que desenvolverão aGVHD poderia permitir a individualização da terapia para uns e
evitaria imunossupressão intensa para outros.
Objetivos: Revelar um classificador molecular preditivo de aGVHD. Descobrir genes
diferencialmente expressos e analisar eventos precoces que desencadeiam aGVHD.
Explorar categorias funcionais e tipos celulares relacionados ao desenvolvimento de
aGVHD.
Casuística e métodos: Foram isolados, amplificados, marcados e co-hidridados com
lâminas de microarray contendo 22.000 sondas, amostras de RNA mensageiro de 89
pacientes submetidos a TCTH HLA-idêntico mieloablativo ou de toxicidade reduzida,
obtido de células mononucleares periféricas durante a enxertia medular. Os pacientes
foram divididos em grupo treino e grupo teste, um modo utilizado para construir um
modelo que discrimine pacientes com e sem aGVHD, e para testar o modelo em
amostras independentes. Os genes informativos foram selecionados utilizando recursive
feature elimination, seguido de sete diferentes algoritmos de classificação multivariados
para estabelecer o classificador molecular no grupo treino. Os genes diferencialmente
expressos entre amostras de pacientes com e sem GVHD foram submetidos a análise de
enriquecimento das vias funcionais e agrupados de acordo com o perfil de expressão
com células e tecidos através do SymAtlas.
Resultados: Encontramos um classificador molecular composto de 233 genes nas
amostras do grupo treino, que foram selecionados baseados na mais precisa
classificação. No grupo teste da amostra, cerca de 80% dos pacientes puderam ser classificados. Para estes pacientes, o classificador mostrou uma acurácia preditiva de
75% (sensibilidade de 71% e especificidade de 78%). Analisando a anotação funcional
dos genes diferencialmente expressos, observamos que em pacientes que
desenvolveram aGVHD, houve aumento de expressao de genes da resposta
antimicrobiana, transporte de gases, metabolismo de hemoglobina, além das
alarminas. Nestas amostras também observamos a diminuição da expressão da IL1 e
outros genes envolvidos na via do NF-kB. Vários genes super-expressos no periodo
precoce do aGVHD foram associados a células precursoras.
Conclusões: Nossos resultados mostram que um classificador molecular é capaz de
identificar pacientes sob alto risco de desenvolver aGVHD. Estabelecer métodos de
diagnóstico preditivo para aGVHD é o primeiro passo para a individualização da
estratégia terapêutica após TCTH. Além disso, os resultados da análise de
enriquecimento funcional e a expressão de genes em diferentes populações celulares,
sugerem que eventos precoces envolvendo múltiplas populações de células
precursoras possam predefinir a interação futura entre o enxerto em desenvolvimento
e o paciente. === Background: Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is an important last
resort therapy for hematological diseases. Unfortunately, the success of a large
proportion of these transplants is limited by graft-versus-host disease (GVHD).
Currently known risk factors for acute GVHD (histoincompatibility, sex mismatch,
older patients, previous pregnancies) do not provide a precise estimate of individual
patient risk and do not help for individualization of the therapy. Early identification of
those patients who will develop aGVHD may allow for individualized treatment, and
also for the reduction of unnecessary treatment for those patients not at risk.
Nowadays, however, there is no diagnostic method that allows prediction of aGVHD.
Objectives: The goal of our study was to reveal a gene expression profile that would
predict the occurrence of aGVHD. In addition, using enrichment of gene ontology
categories, to analyze differentially expressed genes in order to better understand
biology of the events preceding aGVHD.
Material and methods: we collected blood samples from 89 recipients of myeloablative
and reduced conditioning regimen HLA-identical sibling allogeneic hematopoietic
stem cell transplants at the time of successful engraftment. We isolated total RNA from
the peripheral blood mononuclear cells, amplified it, labeled, and co-hybridized to the
microarray slides containing probes for 22,000 genes..The patients were divided into
training and test groups, the former used to build a model discriminating patients with
and without aGVHD and the latter - to test the model on independent samples. We
selected the informative genes using “recursive feature elimination” method followed
by seven different multivariate classification algorithms in order to establish a
molecular classifier in the training set. Then we validated this new classifier in the test
set of patients.. We found differentially expressed genes using T-test and accepted those
with estimated false discovery rate below 10%. We have used Biobase Explain to find
enrichment of functional groups among differentially expressed genes.Results: We found a molecular classifier comprised by 233 gene probes in the training
set of samples which were selected based on the most accurate classification. In the test
group of samples, we found that 80% of patients could be classified based on the
concordance between classification methods as described above. For these patients, the
classifier showed 75% of a predictive accuracy (71% of sensitivity and 78% of
specificity). Analysis of functional annotations of differentially expressed genes showed
that patients that developed acute GVHD have increased expression of antimicrobial
genes, hemaglobin metabolism genes and alarmins. In these samples we also observed
decreased expression of IL-1 and other genes involved in NF-kB activation. Several
genes up-regulated before aGVHD were associated with multiple types of precursor
cells.
Conclusion: Our results show that molecular profiling is able to identify patients under
high risk of acute GVHD at the time of engraftment. Establishing of a predictive
diagnostic method for aGVHD is the first step of individualization of therapeutic
strategy after hematopoetic stem cell transplantation. In addition, the results of
functional enrichment analysis and expression in different cell populations suggest that
early events during engrafment involving precursor cell populations might predefine
results of interaction between stem cell allograft and patient body.
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