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Previous issue date: 2008 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) === Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) === O enfoque do nosso trabalho foi avaliar a antigenicidade de uma cisteína
proteinase recombinante de Leishmania (Leishmania) amazonensis e a capacidade
protetora desse antígeno contra a infecção homóloga em camundongos BALB/c.
Um fragmento de 500 pb do gene Lacys24, codificador de uma isoforma de
cisteína proteinase de L. (L.) amazonensis previamente clonado em nosso
laboratório, foi subclonado e expresso no vetor bacteriano pHis, originando uma
proteína recombinante de 24 kDa, rLacys24. Por experimentos de “Western blotting”
foi demonstrado que anticorpos produzidos contra essa proteína reconhecem uma
banda de 30 kDa do extrato de amastigotas de L. (L.) amazonensis, indicando que a
rLacys24 corresponde a uma isoforma de cisteína proteinase de 30 kDa
abundantemente expressa nesses parasitas.
A antigenicidade da rLacys24 foi avaliada pela análise das populações de
linfócitos dos camundongos BALB/c previamente imunizados com a proteína
recombinante mais Propionibacterium acnes ou adjuvante completo de Freund
(ACF) como adjuvantes. A análise por citometria de fluxo dos linfócitos provindos
dos linfonodos inguinais e poplíteos dos animais imunizados com a rLacys24 + ACF
por via subcutânea mostrou um aumento significante da expressão de linfócitos
CD8+
comparada à dos controles que receberam apenas ACF. Quanto à CD4+
, não
houve diferença na expressão dessa população de linfócitos entre os controles e os
animais imunizados com a rLacys24. Por outro lado, foi baixa a expressão de
linfócitos CD4+
e CD8+
no baço dos camundongos imunizados com a rLacys24 + P.
acnes pela via intraperitoneal.
O ensaio de citotoxicidade dos linfócitos dos camundongos imunizados com a
rLacys24 + ACF foi realizado utilizando-se como células-alvo macrófagos peritoneais
de camundongos BALB/c infectados com L. (L.) amazonensis. A lise dos macrófagos
infectados na presença dos linfócitos dos animais imunizados com a rLacys24 foi
significantemente maior que a observada quando as células-alvo foram incubadas
com os linfócitos dos animais controle.
A imunização ativa dos camundongos BALB/c com a rLacys24 + ACF resultou
em pequeno, porém significante decréscimo das lesões das patas dos animais após
o desafio com a L. (L.) amazonensis, enquanto que nos animais imunizados com a
rLacys24 + P. acnes as lesões apresentaram aumento gradativo até três meses
após o desafio.
No outro esquema de imunização avaliado, os animais foram imunizados com
a cisteína proteinase de amastigotas de L. (L.) chagasi, rLdccys, além da rLacys24,
e P. acnes como adjuvante e desafiados com a L. (L.) amazonensis. A avaliação das
respostas imunes dos animais imunizados foi realizada por citometira de fluxo e pela
detecção por ELISPOT de IFN-γ, IL-4 e IL-10 nas culturas dos linfócitos dos animais
três meses após o desafio. Em todos os animais imunizados houve predomínio da
expressão de linfócitos CD4+
, enquanto que a dos linfócitos CD8+
foi baixa (em torno
de 8-10%). IFN-γ foi secretado pelos linfócitos isolados de todos os animais
estudados, não tendo havido diferenças significantes na secreção dessa linfocina
entre os animais imunizados com os antígenos recombinantes e os controles que
receberam apenas a P. acnes. Enquanto IL-10 não foi detectada nas culturas de
linfócitos de nenhum dos animais imunizados, IL-4 foi secretada pelos linfócitos de
todos os animais estudados. Entretanto, a expressão da IL-4 foi significantemente
menor nas culturas de linfócitos dos animais imunizados com os antígenos
recombinantes comparada à dos controles. Não foram observadas diferenças do
tamanho das lesões das patas dos camundongos imunizados com os antígenos
recombinantes em relação aos controles, sendo esses resultados confirmados
quando a infecção dos animais foi avaliada pelo crescimento em meio axênico dos
parasitas isolados das lesões.
Apesar da reduzida proteção conferida pela rLacys24, os dados do presente
trabalho sugerem que esse antígeno pode ser útil em novos esquemas de
imunização que induzam respostas mediadas por linfócitos CD4+
e CD8+
mais
eficazes contra a infecção pela L. (L.) amazonensis. === Our work focused on the antigenicity of a recombinant cysteine proteinase
from Leishmania (Leishmania) amazonensis and on the protective role of this antigen
in the infection of BALB/c mice with the parasite.
A 500 bp fragment from the Lacys24 gene, encoding an isoform of cysteine
proteinase from L. (L.) amazonensis previously cloned in our laboratory, was
subcloned and expressed in the pHis vector, resulting in a recombinant protein of 24
kDa, rLacys24. In Western blots of L. (L.) amazonensis extracts, antibodies directed
to the rLacys24 antigen recognized a 30 kDa band identified as an isoform of
cysteine proteinase abundantly expressed in these parasites.
The antigenicity of the rLacys24 was evaluated by analysis of the T
lymphocyte profile in BALB/c mice previously immunized with this recombinant
protein plus either Propionibacterium acnes or Freund’s complete adjuvant (CFA).
Lymphocytes isolated from the popliteal and inguinal lymph nodes of animals
immunized with rLacys24 plus CFA by the subcutaneous route were analysed by
fluorescence-activated cell sorter (FACS). A significantly higher expression of CD8+
lymphocytes was observed in animals immunized with rLacys24 plus CFA compared
to the controls which received CFA alone. In contrast, a low expression of CD4+
lymphocytes was observed in these animals. On the other hand, the expression of
CD4+ and CD8+ lymphocytes there was lower in spleens from animals immunized
with rLacys24 plus P. acnes by intraperitoneal route.
The cytotoxicity of lymphocytes isolated from mice immunized with rLacys24
plus CFA was assyed by use of L. (L.) amazonensis-infected macrophages as the
target cells. The cytotoxicity of lymphocytes from rLacys24-immunized mice was
significantly higher than that observed when the target cells were incubated with
lymphocytes from control animals.
Active immunization of BALB/c mice with rLacys24 plus CFA resulted in a low
but significant decrease of foot lesions after challenge with L. (L.) amazonensis in
comparison with the lesion size in control mice. In contrast, there was a similar
increase of foot lesions among mice immunized with rLacys24 plus P. acnes or with
P. acnes alone.
In another immunization protocol, animals were immunized with a recombinant
cysteine proteinase from L. (L.) chagasi, rLdccys1, besides rLacys24, plus P. acnes
as the adjuvant. Immune responses were evaluated by FACS and ELISPOT for
detection of IFN-γ, IL-4 and IL-10 in lymphocyte cultures from animals three months
after challenge with L. (L.) amazonensis. All of the immunized animals showed a
predominance of T CD4+ lymphocytes and a low expression of CD8+
(8-10%). IFN-γ
was secreted by lymphocytes isolated from all immunized animals and there were no
significant differences of IFN-γ secretion among animals immunized with the
recombinant antigens or with P. acnes alone. IL-10 was not detected in lymphocyte
cultures from the immunized animals. However, IL-4 expression was significantly
lower in lymphocyte cultures from animals immunized with the recombinant antigens
compared to the controls. There were no significant differences in foot lesion size
from BALB/c mice immunized with the recombinant antigens compared to the
controls; these results were confirmed by estimates of parasites isolated from the foot
lesions.
In spite of the low protection conferred by the rLacys24, our data suggest that
this recombinant antigen may be useful in new immunization schedules aiming to
elicit more efficient CD4+
and CD8+
protective responses against L. (L.) amazonensis
infection. === BV UNIFESP: Teses e dissertações
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