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Previous issue date: 2005 === Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) === Objetivos: (a) Padronizar protocolos rápidos da técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE) para tipagem molecular de amostras clínicas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa; (b) Avaliar a tipabilidade, o poder discriminatório e a reprodutibilidade entre os protocolos rápidos de PFGE versus o protocolo convencional para as amostras de S. aureus, E. coli e P. aeruginosa; (c) Analisar
os resultados da tipagem molecular pela técnica do PFGE de acordo com dois critérios distintos de interpretação, os critérios de PFALLER et al. (1992) e os critérios de TENOVER et al. (1995). Métodos: Um total de 60 amostras bacterianas das seguintes espécies bacterianas foi selecionado: S. aureus (n=20), E. coli (n=20) e P. aeruginosa
(n=20). Todos amostras foram isoladas da corrente sanguínea de pacientes internados no Hospital São Paulo (HSP) no período de 2000 a 2004. Quinze dos 20 isolados clínicos de cada espécie bacteriana foram selecionados de pacientes previamente caracterizados como não relacionados epidemiologicamente, pela Comissão de Controle de Infecção Hospitalar do HSP. As outras cinco amostras de cada espécie bacteriana foram classificadas como amostras bacterianas possivelmente relacionadas epidemiologicamente, provenientes de uma mesma unidade do HSP em um período de tempo igual ou inferior a três meses. Protocolos convencionais da técnica PFGE foram reproduzidos e protocolos rápidos desta mesma técnica foram padronizados, após digestão destas bactérias com as enzimas de restrição SmaI e SpeI. Os perfis moleculares foram analisados visualmente e interpretados de acordo com os critérios de Pfaller et al (1992) e Tenover et al (1995). Resultados: Os protocolos convencionais e rápidos de PFGE apresentaram resultados idênticos para tipagem das amostras clínicas de S.aureus, E. coli e P. aeruginosa. De acordo com os critérios de Pfaller et al. (1992), foram encontrados nas amostras clínicas de S. aureus, E. coli e P. aeruginosa deste estudo, 17, 13 e 7 padrões diferentes de PFGE, respectivamente. Seguindo os critérios de Tenover et al. (1995) foram encontrados 16, 11 e 6 padrões distintos de PFGE nas amostras de S. aureus, E. coli e P. aeruginosa, respectivamente. As técnicas desenvolvidas tanto pelos protocolos rápidos quanto pelos protocolos convencionais apresentaram percentual de tipabilidade e reprodutibilidade de 100%. O poder discriminatório foi de 95%, 94% e 82% para as amostras clínicas de S. aureus e E.coli e P. aeruginosa, respectivamente. Conclusões: Foram padronizados protocolos rápidos para tipagem molecular de amostras de S. aureus (42hs), E. coli (43hs) e P. aeruginosa (56hs) pela técnica de PFGE. Todos protocolos testados apresentaram excelente tipabilidade e reprodutibilidade. O poder discriminatório foi excelente para as amostras clínicas de S. aureus e E. coli, e satisfatório para as amostras de P. aeruginosa, devido a pouca diversidade clonal. Os critérios de Pfaller et al. (1992) diferenciaram melhor a presença de novos clones quando comparados aos critérios de Tenover et al. (1995). === Objectives: (a) To develop rapid protocols of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) technique for molecular typing of clinical samples of Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa; (b) To evaluate the typeability, the discriminatory power, and the reproducibility between rapid and conventional PFGE protocols for clinical isolates of S. aureus, E. coli and P. aeruginosa, (c) To analyze PFGE results according to two different interpretation criteria, one from Pfaller et al. (1992) and the other from Tenover et al. (1995). Methods: A total of 60 bacteria samples were selected from the following species: S. aureus (n=20), E. coli (n=20), and P. aeruginosa (n=20), isolated from
bloodstream infections from patients from Hospital São Paulo (HSP). Among the 20 clinical isolates from each specie, 15 were selected from patients previously characterized by the hospital’s Infection Control Department of HSP as epidemiologically non-related. The other
five isolates were characterized as possible epidemiologically related. These samples were collected from the same medical ward of HSP, in a period of time equal to or less than 3 months. The conventional PFGE protocols were reproduced, and the rapid protocols were developed, after DNA digestion with SmaI and SpeI enzymes. The molecular patterns were examined visually and interpreted according to Pfaller et al. (1992) and Tenover et al.(1995) criteria. Results: The rapid and conventional PFGE protocols presented similar results for S. aureus, E. coli, and P. aeruginosa isolates. According to Pfaller et al. (1992), a total of 17, 13, and 7 distinct PFGE patterns were identified for S. aureus, E. coli, and P. aeruginosa, respectively. On the other hand, by Tenover criteria, a total of 16, 11 and 6 distinct PFGE patterns were found for S. aureus, E. coli and P. aeruginosa, respectively. All protocols tested presented 100% of reproducibility and typeability. The discriminatory power was 95%, 94%, and 82% for S. aureus, E. coli, and P. aeruginosa, respectively.
Conclusions: Rapid PFGE protocols were developed for S. aureus (42hs), E. coli (43hs) and P. aeruginosa (56hs), and all of them presented excellent reproducibility and typeability. The discriminatory power was excellent for clinical isolates of S. aureus and E.
coli, and satisfactory for P. aeruginosa; probably because of the low clonal diversity of this specie identified in this study. Compared to Tenover et al. (1995) criteria, Pfaller et al. (1992) could better differentiate the presence of new bacterial clones. === FAPESP: 2006/57700-0 === BV UNIFESP: Teses e dissertações
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