Isolamento, purificação parcial e caracterização bioquimica da aspartato quinase e homoserina desidrogenase de sementes de sorgo

• Main Author: Ferreira, Renato Rodrigues
• Other Authors: UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: [s.n.] 2004
• Subjects: Sorgo
• Online Access: FERREIRA, Renato Rodrigues. Isolamento, purificação parcial e caracterização bioquimica da aspartato quinase e homoserina desidrogenase de sementes de sorgo. 2004. 97p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/317257>. Acesso em: 3 ago. 2018.; http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/317257

Orientador: Ricardo Antunes de Azevedo === Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia === Made available in DSpace on 2018-08-04T00:20:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_RenatoRodrigues_D.pdf: 6788820 bytes, checksum: ee446f0d547286ce3e831468ade7cf97 (MD5) Previous issue date: 2004 === Resumo: Sementes de cereais não são boas fontes de aminoácidos essenciais, particularmente lisina e treonina, sintetizados a partir da via metabólica do ácido aspártico. Embora muitas enzimas desta via tenham sido estudadas em várias espécies de plantas superiores, o metabolismo de lisina e treonina ainda é totalmente desconhecido em sorgo. Neste trabalho, foram estudadas duas enzimas, aspartato quinase (AK) e homoserina desidrogenase (HSDH). Condições ótimas de ensaio foram estabeleci das para a determinação das atividades de AK e HSDH. Os maiores níveis de atividade foram observados em sementes imaturas de sorgo, utilizando-se para ambos ensaios 50 _L de amostra e um período de incubação de 10 à 30 min, dependendo da enzima a ser avaliada e da concentração de proteínas da extrato. Particularmente para HSDH, o co-fator mais efetivo para determinação de atividade foi o NADP. Precipitação com sulfato de amônia, cromatografia de troca aniônica e cromatografia de filtração em gel foram os métodos de separação de proteínas utilizados para purificar e identificar as isoenzimas de AK e HSDH de sementes de sorgo. Dois picos de atividade de AK foram eluídos a partir de coluna de troca aniônica (DEAE-Sephacel) com 183 e 262 mmol.L-1 KCl. Os dois picos foram fortemente inibidos por lisina. Com relação à HSDH, dois picos sobrepostos foram eluídos com 145 e 183 mmol.rl KCI, sendo o primeiro pico resistente à inibição por treonina e o segundo sensível à inibição por este aminoácido. Entretanto, através de coluna cromatográfica de filtração em gel (Sephacryl S-200) foi observado um pico de atividade de AK co-eluído juntamente com o pico de HSDH, ambos sensíveis à inibição por treonina, sugerindo a presença de uma isoenzima bifuncional AK-HSDH em sorgo e a massa molecular dessa isoenzima foi estimada em 164 kDa. AAK foi purificada cerca de 30 vezes pelos métodos utilizados. As atividades de AK e HSDH foram estudas na presença de lisina, treonina, metionina, valina, cálcio, EOTA, calmodulina, SAM, AEC e concentrações crescentes de KCl. A AK foi inibida por treonina e lisina, confirmando a existência de duas isoenzimas, uma sensível à inibição por treonina e outra à inibição por lisina, sendo esta última predominante em sementes de sorgo. Metionina, SAM + lisina e AEC, também inibiram a atividade de AK, entretanto, KCI e cálcio também não promoveram alterações na atividade desta enzima, confirmando que a AK de sorgo não é regulada por cálcio. HSDH foi inibida por treonina indicando a existência de uma HSDH sensível à treonina, porém, a maior parte da atividade não foi inibida por treonina, confirmando a existência de uma segunda HSDH quantitativamente predominante, resistente à inibição por treonina. Valina e SAM + treonina também inibiram a atividade de HSDH enquanto que KCI e cálcio não promoveram nenhuma alteração na atividade da enzima. Com relação às proteínas de reserva de sorgo presentes nas sementes do híbrido comercial MASSA 03, foi observada alta concentração de glutelinas e baixa concentração de kafirinas, equivalentes às concentrações encontradas nos mutantes alta lisina. Semelhantemente, em relação aos aminoácidos solúveis, o sorgo MASSA 03, também apresentou concentrações compatíveis às dos genótipos mutantes alta lisina, sugerindo que este híbrido comercial também apresenta característica de alta lisina. Entretanto, para programas de melhoramento, o genótipo de sorgo mais viável seria o mutante IS 16227, devido a seu alto desempenho no que diz respeito às proteínas de reserva e aminoácidos solúveis === Abstract: Cereal seeds are poor sources of essential amino acids, in particular lysine and threonine, which are synthesized as part of the aspartic acid metabolic pathway. Many of the enzymes of this pathway have been studied in several higher plants species, however, the metabolism of lysine and threonine in sorghum is unknown. In this work were studied two of the enzymes of this pathway in sorghum, aspartate kinase (AK) and homoserine dehydrogenates (HSDH). Assay conditions were optimized for the determination of AK and HSDH activities. The highest levels of activity for both enzymes were observed from immature sorghum seeds using 50 J.1L of sample and an incubation period from 10 to 30 min. The co-factor that had the greatest effect on HSDH activity was NADP. To separate, purify and identify the various isoforms of the AK and HSDH from sorghum seeds, the extracts were subjected to ammonium sulphate precipitation, anionexchange chromatography and gel filtration chromatography. Two AK activity peaks at 183 and 262 mmol.L-1 KCL were eluted by anion-exchange chromatography (DEAE-Sephacel). Both of these activity peaks were strongly inhibited by lysine. For HSDH, two activity peaks were eluded at 145 and 183 mmol.L"1 KCI, with the first peak being resistant to threonine inhibition while the second was sensitive to threonine inhibition. However, through gel filtration chromatography (Sephacryl S-200), one peak of AK activity co-eluted with one peak of HSDH and both were sensitive to threonine inhibition, suggesting the presence of a bifunctional AKHSDH isoenzyme in sorghum, with a molecular mass estimated as 164 kDa. Using these protein separation methods, AK was partially purified by 30-fold when compared to the crude extract. The activities of AK and HSDH were studied in the presence of lysine, threonine, methionine, valine, calcium, EGTA, calmodulin, SAM, AEC and increasing concentrations of KCl. AK showed inhibition by threonine and lysine confirming the existence of two isoenzymes, one sensitive to threonine and the other sensitive to lysine, the latter being predominant in sorghum seeds. Methionine, SAM plus lysine and AEC also inhibited AK activity, however, increasing KCI concentrations and calcium did not produce any significant effect on AK activity, confirming that calcium does not play a role in AK regulation in sorghum seeds. HSDH also exhibited some inhibition by threonine, but the majority of its activity was not inhibited, thus indicating the existence of a threonine sensitive isoenzyme and a second predominant isoenzyme, which was resistant to threonine inhibition. Valine and SAM plus threonine also inhibited HSDH, however, increasing concentrations of KCl and calcium had no inhibitory effect. Regarding seed storage proteins of sorghum, the commercial hibrid MASSA 03 used in this study showed a high concentration of glutelins and a low concentration of kafirins similarly to what was described for several high lysine mutants lines. Furthermore, the concentration of soluble amino acids was also compatible to those of the high lysine mutant lines, which suggest that this commercial hibrid may also be considered as a high lysine sorghum. Finally, for genetic improvement programs, the sorghum mutant genotype 1S 16227 should be evaluated due to its higher contents and quality of its seed storage proteins and soluble amino acid === Doutorado === Genetica Vegetal e Melhoramento === Doutor em Genetica e Biologia Molecular