Estudos funcionais e estruturais da proteina reguladora humana Ki-1/57

• Main Author: Nery, Flavia Cristina
• Other Authors: UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: [s.n.] 2005
• Subjects: Proteína Ki-1/57; Rack-1; Proteina quinase C; Signaling; Phosphorylation; Ki-1/57; Protrin Kinase C
• Online Access: NERY, Flavia Cristina. Estudos funcionais e estruturais da proteina reguladora humana Ki-1/57. 2005. 117p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/316877>. Acesso em: 4 ago. 2018.; http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/316877

Orientador: Jorg Kobarg === Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia === Made available in DSpace on 2018-08-04T15:24:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nery_FlaviaCristina_D.pdf: 4972440 bytes, checksum: 86b749df91267d19e655449a4dfc3d0c (MD5) Previous issue date: 2005 === Resumo: Ki-1/57 é um antígeno humano de 57kDa reconhecido pelo anticorpo Ki-1, o qual também reconhece CD30. Ki-1/57 se encontra no núcleo e no citoplasma sendo fosforilado nos resíduos de serina e de treonina após a ativação das células. Quando Ki-1/57 foi isolado da linhagem L540 de células de linfoma de Hodgkin, ela co-imunoprecipitou com atividade quinase em resíduos de Ser/Thr. Além disso, foi relatado que Ki-1/57 interage com o ácido hialurônico e conseqüentemente foi denominada de ¿proteína intracelular que se liga a hialuronato 4¿ (IHABP4). Nós usamos o sistema de duplo híbrido em levedura e encontramos que Ki-1/57 interage especificamente com a proteína com domínios cromo-helicase e de ligação ao DNA 3 (CHD3), uma proteína nuclear envolvida em remodelagem da cromatina e regulação da transcrição, e com RACK1 (¿proteína adaptadora para quinase C ativada¿). A interação entre Ki-1/57 e seus ligantes foi confirmada por outros experimentos in vitro e in vivo. Interessantemente, a interação entre Ki-1/57 e RACK1 foi abolida após fosforilação da Ki-1/57 e observamos que o estímulo de células L540 e HeLa com 4 a -forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) resulta na saída de Ki-1/57 do núcleo. Ki-1/57 também demonstrou ser um substrato para proteína quinase C (PKC) quando ativada com PMA, e sua fosforilação foi confirmada in vitro e in vivo. Esses dados sugerem que Ki-1/57 está associada com a via de sinalização celular de RACK1/PKC e isto pode ser importante para a regulação de suas funções nucleares. Sua interação com CHD3 e com outras proteínas envolvidas na regulação transcricional, tais como: Topors, Daxx e Tip60, entre outras, sugere que Ki-1/57 pode ter uma função neste contexto funcional. RACK1 interage com p73, um parálogo de p53, inibindo sua ativação transcricional. Nós ainda encontramos que Ki-1/57 também interage com p53 não fosforilada e pode inibir sua ativação transcricional. A estrutura tridimensional da proteína Ki-1/57 é desconhecida, mas nossos estudos espectroscópicos mostraram que a proteína Ki-1/57 é predominantemente constituída por folhas b-pregueadas. Além disso, Ki-1/57(122-413) apagou o sinal do espectro de CD de RACK1 entre 229-300 nm, que é característico de proteínas ricas em triptofanos, e também diminuiu a intensidade de emissão de fluorescência de RACK1. Isso sugere que Ki-1/57 interage com os triptofanos na superfície de RACK1 === Abstract: Ki-1/57, the 57-kDa human protein antigen recognized by the CD30 antibody Ki-1, is a cytoplasmic and nuclear protein, which is phosphorylated on serine and threonine residues upon cell activation. When isolated from the Hodgkin¿s lymphoma analogous cell line L540 Ki-1/57 was co-immunoprecipitated with a Thr/Ser protein kinase activity. It has been also found to interact with hyaluronic acid and has therefore been termed intracellular hyaluronan binding protein 4 (IHABP4). We used the yeast-two-hybrid system to identify proteins interacting with Ki-1/57 and found that Ki-1/57 engages in specific interactions with the Chromatin-Helicase-DNA-binding domain protein 3 (CHD3), a nuclear protein involved in chromatin remodeling and transcription regulation, and with the adaptor protein Receptor of Activated Kinase-1 (RACK1). Next, we confirmed these interactions by in vitro and in vivo experiments. Interestingly, the interaction of Ki-1/57 with RACK1 is abolished upon activation of L540 cells with 4a-phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), which results in the phosphorylation of Ki-1/57 and its exit from the nucleus. We demonstrated that Ki-1/57 also co-precipitates with protein kinase C (PKC) when isolated from PMA activated L540 tumor cells and is a substrate for PKC phosphorylation in vitro and in vivo. These events associate Ki-1/57 with the RACK1/PKC pathway and may be important for the regulation of its nuclear functions. Its interaction with chromatin remodeling factors such as CHD3 and other proteins involved in transcriptional regulation including Topors, Daxx and Tip 60 may suggest that Ki-1/57 has also a function in this context and that this function is subject to regulatory events involving the PKC/RACK1 signaling pathway. RACK1 also interacts with the p53 paralogue p73. In that case, the physical binding of RACK1 to p73 can inhibit its transcription activation function. We found out that Ki-1/57 interacts with unphosphorylated p53 and that this binding inhibits p53 transcription activation function. The three-dimensional structure of Ki-1/57 is still unknown but our spectroscopic studies demonstrated that Ki-1/57 consists predominantly of b-sheets. Binding of Ki-1/57(122-413) to RACK1 abolishes its positive ellipticity at 229-300 nm, which is characteristic for tryptophan-rich proteins, and decreases its emission fluorescence. This suggests that surface tryptophans of RACK1 are involved in the interaction with Ki-1/57 === Doutorado === Genetica Humana e Medica === Doutor em Genetica e Biologia Molecular