Atividade de lectinas de sementes de Cratylia mollis sobre a função mitocondrial e viabilidade de Trypanosoma cruzi

• Main Author: Fernandes, Mariana Pinheiro
• Other Authors: UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: [s.n.] 2010
• Subjects: Trypanosoma cruzi; Mitocôndria; Cálcio; Espécies de oxigênio reativas; Morte celular; Lectinas; Mitochondria; Calcium; Reactive oxygen species; Cell death; Lectin
• Online Access: FERNANDES, Mariana Pinheiro. Atividade de lectinas de sementes de Cratylia mollis sobre a função mitocondrial e viabilidade de Trypanosoma cruzi. 2010. 160 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/311344>. Acesso em: 15 ago. 2018.; http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/311344

Orientadores: Anibal Eugenio Vercesi, Fernanda Ramos Gadelha === Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas === Made available in DSpace on 2018-08-15T13:24:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_MarianaPinheiro_D.pdf: 41725038 bytes, checksum: ed76a74896573daa3ea8087e075ca302 (MD5) Previous issue date: 2010 === Resumo: Lectinas são proteínas ou glicoproteínas que reconhecem glicoconjugados de superfície celular. Neste trabalho, nós investigamos se a lectina de sementes de Cratylia mollis (Cramoll 1,4) tem efeitos tóxicos em Trypanosoma cruzi. Cramoll 1,4 reconheceu glicoconjugados presentes na superfície celular dos parasitas, levando a aglutinação de epimastigotas e tripomastigotas, de uma maneira dose dependente (1-50 µg/ml). Além disso, Cramoll 1,4 diminuiu a proliferação de epimastigotas; 93% de inibição foi obtida com 50 µg/ml. A incubação de células (1.25 x 108 /ml) na presença de Cramoll 1,4 (50 |ig/ml) e Ca2+ (10µM) por 1 h induziu permeabilização de membrana plasmática seguida por influxo de Ca2+ e cúmulo de Ca2+ mitocondrial, resultado que se assemelha ao efeito clássico da digitonina. Cramoll 1,4 estimulou (cinco vezes) a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) mitocondrial, diminuiu de maneira significativa o potencial elétrico de membrana mitocondrial (??m) e prejudicou a fosforilação de ADP. A geração de EROs induzida por Cramoll 1,4 foi diminuída de forma significativa por EGTA. A permeabilização de membrana plasmática por digitonina (20 µM) em meio contendo Ca2+ também estimulou a geração de EROs mitocondrial, mas numa proporção menor que Cramoll 1,4. A velocidade de respiração desacoplada em epimastigotas não foi afetada pelo tratamento com Cramoll 1,4 + Ca2+ mas a respiração de repouso induzida por oligomicina foi 65% maior nas células tratadas do que nos controles. Experimentos usando frações mitocondriais de T. cruzi (MTc) mostraram que, em contraste com a digitonina, a lectina diminuiu de forma significativa o ??m por um mecanismo sensível a EGTA. Em concordância com os resultados da permeabilização de membrana plasmática e prejuízo da fosforilação oxidativa pela lectina, experimentos de microscopia de fluorescência usando iodeto de propídeo revelaram que Cramoll 1,4 induziu morte de epimastigotas por necrose. Experimentos feitos com mitocôndrias isoladas de fígado de rato (MFR) mostraram que Cramoll 1,4 induziu transição de permeabilidade mitocondrial, dependente de Ca2+, com aumento na produção de EROs. Em contraste ao que foi observado em MFR, o efeito de Cramoll 1,4 em MTc é insensível a ciclosporina A, um inibidor clássico do poro de transição de permeabilidade mitocondrial. Nós mostramos que a toxicidade de Cramoll 1,4 em epimastigotas parece resultar de uma ação conjunta nas membranas plasmática e mitocondrial do parasita, sobrecarga de Ca2+ mitocondrial e produção de EROs === Abstract: Lectins are proteins or glycoproteins that recognize cell surface glycoconjugates. In this work, we investigated whether Cratylia mollis seed lectin (Cramoll 1,4) has toxic effects on Trypanosoma cruzi. Cramoll 1,4 recognized glycoconjugates present on the cell surfaces of parasites, leading to agglutination of both epimastigotes and trypomastigotes in a dose-dependent manner (1-50 µg/ml). In additional, Cramoll 1,4 decreased epimastigote proliferation; 93% inhibition was attained at 50 µg/ml. Incubation of cells (1.25 x 108 /ml) in the presence of 50 µg/ml Cramoll 1,4 and 10 Ca2+ for 1 h induced plasma membrane permeabilization followed by Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ accumulation, a result that resembles the classical effect of digitonin. Cramoll 1,4 stimulated (five-fold) mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production, significantly decreased the electrical mitochondrial membrane potential (??m) and impaired ADP phosphorylation. ROS generation induced by Cramoll 1,4 was significantly diminished by EGTA. Plasma membrane permeabilization by 20 digitonin in a Ca2+ -containing medium also stimulated mitochondrial ROS generation but at a lower rate than Cramoll 1,4. The rate of uncoupled respiration in epimastigotes was not affected by Cramoll 1,4 plus Ca2+ treatment, but oligomycin-induced resting respiration was 65% higher in treated cells than in controls. Experiments using T. cruzi mitochondrial fractions (MTc) showed that, in contrast to digitonin, the lectin significantly decreased ??m by a mechanism sensitive to EGTA. In agreement with the results showing plasma membrane permeabilization and impairment of oxidative phosphorylation by the lectin, fluorescence microscopy experiments using propidium iodide revealed that Cramoll 1,4 induced epimastigote death by necrosis. Experiments performed with rat liver mitochondria (RLM) showed that Cramoll 1,4 induced Ca2+-dependent mitochondrial permeability transition increasing the ROS production. In contrast to RLM, the Cramoll 1,4 effect in MTc is insensitive to cyclosporin A, a classic inhibitor of mitochondrial permeability transition pore. We showed that Cramoll 1,4 toxicity to T. cruzi epimastigotes seems to result from a concerted action on the parasite's plasma and mitochondrial membranes, mitochondrial Ca2+ overload and ROS production === Doutorado === Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento === Doutor em Fisiopatologia Medica