Avaliação da factibilidade da terapia gênica com vetores não virais na sepse experimental murina

• Main Author: Faiotto, Vanessa Boury, 1989-
• Other Authors: UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
• Format: Others
• Published: [s.n.] 2015
• Subjects: Terapia genética; Vetores genéticos; Sepse; Transfecção; Genetic therapy; Genetic vectors; Sepsis; Transfection
• Online Access: FAIOTTO, Vanessa Boury. Avaliação da factibilidade da terapia gênica com vetores não virais na sepse experimental murina. 2015. 98 p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/309170>. Acesso em: 26 ago. 2018.; http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/309170

Orientador: Erich Vinícius de Paula === Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas === Made available in DSpace on 2018-08-26T18:53:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faiotto_VanessaBoury_M.pdf: 2777980 bytes, checksum: 26068f6f5813665c531b744d7a8c8f60 (MD5) Previous issue date: 2015 === Resumo: A sepse representa uma condição potencialmente fatal em que a resposta do organismo a uma infecção resulta em lesão em seus próprios tecidos. A terapia gênica (TG) consiste na modificação do repertório de células somáticas com fins terapêuticos, substituindo genes defeituosos que causam doenças. Na sepse, vetores não virais podem representar uma estratégia excelente para a transferência do gene terapêutico, uma vez que não provoca resposta imune significativa e são expressos apenas transitoriamente. Além disso, a sua produção é mais simples. Métodos: O estudo foi dividido em três etapas. Em primeiro lugar, dois genes repórter (lacZ e F9) foram testados em dois modelos experimentais de sepse (endotoxemia e ligadura e punção cecal, CLP) para confirmar a viabilidade da transferência gênica no contexto da sepse. A expressão foi avaliada por métodos qualitativos (histoquímica) e quantitativos (avaliação funcional; métodos coagulométricos). Em seguida avaliou-se a eficácia terapêutica da transferência do gene de sFlt-1, um antagonista de VEGF natural, no modelo de endotoxemia. A expressão foi avaliada por ELISA, e a eficácia foi avaliada através de uma curva de sobrevida. Os camundongos foram tratados com o plasmídeo DNA (pDNA) contendo o cDNA do gene Flt1 (tratamento) lacZ (controle), 6 horas após o desafio com LPS. A propósito, sFlt-1 foi capaz de proteger da sepse experimental murina em outros estudos, devido a sua propriedade estabilizadora da barreira endotelial (BE). Na última etapa, avaliamos os níveis séricos de quatro proteínas envolvidas na modulação da integridade BE, utilizando amostras de soro de indivíduos diagnosticados com sepse grave e choque séptico (n = 53), através de um kit Multiplex comercial. Resultados: No primeiro passo, a transferência gênica por vetores não virais foi demonstrada no modelo de endotoxemia, pois tanto a expressão de ?-galactosidase quanto de F IX mostraram-se aumentadas nos animais tratados neste modelo. A expressão não foi confirmada no modelo CLP, embora o número reduzido de animais por grupo não permita uma conclusão definitiva sobre o assunto. Em relação à segunda etapa, apenas 4/14 animais tratados apresentaram níveis detectáveis de sFlt-1 por Elisa. Além disso, não houve diferença na sobrevida entre os animais tratados e controles. Juntos, estes resultados confirmam que a transferência gênica com vetores não virais é possível no contexto de uma inflamação grave, mas apresenta baixa eficiência e previsibilidade. Por fim, observamos diferenças significativas nos níveis séricos de endoglina (maior expressão) e HB-EGF (menor expressão) em pacientes com choque séptico, em comparação ao grupo controle. Os níveis de BMP-9 e FGF-2 não foram significativamente diferentes no choque séptico. Conclusões: Nosso estudo nos permite concluir que, apesar de factível, a utilização de vetores não-virais não parece representar uma estratégia terapêutica eficaz na sepse experimental. Maiores estudos são necessários para validar o uso de endoglina e HB-EGF como biomarcadores de sepse grave === Abstract: Sepsis represents a potentially fatal condition that occurs when the body's response to infection results in injury to its own tissues. Gene therapy (GT) consists in modification of the repertory of somatic cells with therapeutic purposes, replacing defective genes that cause diseases. In sepsis, non-viral vectors, could represent an excellent strategy for therapeutic gene transfer, since they do not elicit intense immune responses in the individual and are expressed only transiently. Besides, their production is easy and inexpensive. Methods: The study was divided in 3 steps. First, two reporter genes (lacZ and F9) were tested in two experimental models of sepsis (endotoxemia and cecal ligation and puncture, CLP) to confirm the feasibility of gene transfer in the context of sepsis. We assessed expression by qualitative (histochemistry) and quantitative methods (functional evaluation, through coagulometric methods). Next we evaluated the efficacy of the therapeutic gene transfer of sFlt-1, a natural VEGF antagonist, in the endotoxemia model. Expression was evaluated by ELISA, and efficacy was evaluated by a survival curve. Mice were treated with pDNA containing the Flt1 (treatment) or lacZ (control) cDNA, 6 hours after challenge with LPS. Of note, sFlt-1 has been previously shown to protect from experimental sepsis due to its endothelial barrier (EB) stabilizing properties. In the last step, we evaluated serum levels of 4 proteins involved in the modulation of EB integrity, using serum samples of subjects diagnosed with severe sepsis and septic shock (n=53), through a commercial Multiplex kit. Results: In the first step, we could confirm the expression of both reporter genes by non-viral vectors in the endotoxemia model. Of note, expression of ?-galactosidase showed a notable increase when compared with control group. Similarly, we noted increased expression of factor IX in the mice which were submitted to gene transfer with pDNA, when compared with the controls that received the lacZ pDNA (111,4 ± 16,10 vs 64,73 ± 12,34; p<0,001) in the endotoxemia model, and similar result in the group without sepsis induction by endotoxemia (163,4± 73,46 vs 79,88 ± 9,39; p=0,0006). Expression was not confirmed in the CLP model, although the limited number of animals per group does not allow a definite conclusion on this matter. In relation to the second step, only 4/14 treated animals presented detectable levels of sFlt-1 by Elisa. In addition, no difference could be observed in the survival between treated and control animals. Together, these results confirme that gene transfer with non-viral vectors is feasible in the context of severe inflammation, but with a low efficiency and predictability. Finally, we demonstrated significant differences in serum levels of endoglin (higher expression) and HB-EGF (lower expression) in patients with septic shock, compared to controls. BMP-9 and FGF-2 levels were not significantly different in septic shock. Conclusions: Our study allows us to conclude that although feasible, the use of non-viral vectors does not seem to represent an effective therapeutic strategy in experimental sepsis. Larger studies are needed to validate the use of endoglin and HB-EGF as biomarkers of severe sepsis === Mestrado === Clinica Medica === Mestra em Ciências