Embriogênese somática e transformação genética de soja via biobalística

• Main Author: Santos, Roberta Borges dos [UNESP]
• Other Authors: Universidade Estadual Paulista (UNESP)
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Estadual Paulista (UNESP) 2014
• Subjects: Soja - Cultivares; Tecidos vegetais - Cultura e meios de cultura; Genes; Regeneração (Biologia); Plant tissue culture
• Online Access: http://hdl.handle.net/11449/92640

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-06-22Bitstream added on 2014-06-13T19:33:23Z : No. of bitstreams: 1 santos_rb_me_jabo.pdf: 1467164 bytes, checksum: 5cce9136001027d260fc80ff1c5229f4 (MD5) === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) === Os objetivos do presente trabalho foram (i) identificar uma cultivar de soja (Glycine max) com melhor resposta in vitro para indução de calos e regeneração; (ii) otimizar o processo de transformação genética via biobalística em embriões oriundos de cotilédone maduros de soja. Os experimentos de indução de calos e transformação genética foram realizados com as cultivares IAS-5, BR16 e MSOY6101. Para indução de calos foram utilizadas altas doses de auxinas [5 mg/L 2,4D (2,4-diclorofenoxiacético- 2,4D), 5 mg/L 2ip (2-isopenteniladenina) e 10 mg/L ANA (ácido-naftalenacético)] e para regeneração de 0 a 2 mg/L de BAP (6-benzylaminopurine), adicionando-se 0,5 mg/L de ANA em todos os tratamentos. Vários parâmetros foram testados na transformação: concentração do tungstênio; BAP (0 a 5 mg/L) no co-cultivo e a concentração de canamicina para seleção de plantas. A construção utilizada foi constituída pelo vetor pCAMBIA 2301, contendo o gene repórter GUS, regulado pelo promotor constitutivo 35SCaMV e adição do gene de seleção NPTII que confere resistência a canamicina. Foram observadas diferenças para a indução e regeneração via embriogênese somática entre as cultivares de soja, resultando na seleção da cultivar 'IAS-5' para avaliação do potencial embriogênico quanto à diferenciação e regeneração de plantas. Essa cultivar apresentou alta taxa de indução, proliferação e regeneração estável. Os resultados mostraram que a adição de 0,5 mg/L de BAP ao meio de regeneração e 5 mg/L de 2,4D ao meio de indução aumentaram as taxas de diferenciação dos embriões de 0 para 27,77%. A partir dos resultados observados na transformação genética em N. benthamiana, adotou-se 24 mg/μL de tungstênio por membrana para as três cultivares de soja. Para regeneração em embrião maduro de soja o melhor resultado... === The present work aimed to (i) identify the best soybean (Glycine max) cultivar for in vitro response for callus induction and plant regeneration; (ii) optimize genetic transformation of soybean mature cotyledon embryo via biobalistic. The callus induction and genetic transformation experiments were performed using IAS- 5, BR16 and MSOY6101 soybean cultivars. High auxin levels (5 mg/L 2,4- diclorofenoxiacetic, 5 mg/L 2-isopenteniladenine and 10 mg/L acid-naftalenacetic) were used for callus induction and to regeneration, adding 0,5 mg/L of acid-naftalenacetic and 0 to 2 mg/L of 6-benzylaminopurine (BAP), in all the treatments of regeneration. The following parameters were tested in order to optimize the transformation: tungsten concentration; BAP concentration (0 to 5 mg/L) in the co-cultivation medium and Kanamycin concentration in the selection medium. The genetic construction used was comprised of pCAMBIA2301 vector, containing gusA gene reporter, under the regulation of 35SCaMV constitutive promoter and NPTII selection gene that provides resistance to Kanamycin. Some differences were observed at the induction and regeneration of somatic embryogenesis among the three cultivars and only IAS-5 cultivar was selected for the assessment of embryogenic potential regarding plant differentiation and regeneration. This cultivar presented high level of callus induction, stable proliferation and stable regeneration. The results showed that the addition of 5 mg/L of 2,4D to the induction medium and 0,5 mg/L of BAP to the regeneration medium increased the levels of differentiation of the IAS-5 soybean embryos from 0 to 27,77%. Based on the results observed in the genetic transformation in N. benthamiana, 24 mg/μL of tungsten per membrane is now being used in the bombardment for the three soybean cultivars... (Complete abstract click electronic access below)