Polímeros biomiméticos nanomagnéticos com acesso restrito (RAMIP magnéticos) obtidos por síntese semicovalente e não covalente visando aplicação em imunossensores e imunoensaios

• Main Author: Pupin, Rafael Rovatti [UNESP]
• Other Authors: Universidade Estadual Paulista (UNESP)
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Estadual Paulista (UNESP) 2017
• Subjects: Biotina; Polímeros molecularmente impressos; ELISA magnético; Fluxo lateral; Ensaios biomiméticos; Polímeros magnéticos
• Online Access: http://hdl.handle.net/11449/151467

Submitted by Rafael Rovatti Pupin null ([e-mail]) on 2017-08-29T13:22:26Z No. of bitstreams: 1 Dissertação vs Final_Rafael R Pupin.pdf: 10462297 bytes, checksum: 951bd5aafaf22295492104d7289dc376 (MD5) === Approved for entry into archive by Luiz Galeffi ([e-mail]) on 2017-08-29T18:21:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pupin_rr_me_araiq.pdf: 10462297 bytes, checksum: 951bd5aafaf22295492104d7289dc376 (MD5) === Made available in DSpace on 2017-08-29T18:21:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pupin_rr_me_araiq.pdf: 10462297 bytes, checksum: 951bd5aafaf22295492104d7289dc376 (MD5) Previous issue date: 2017-08-04 === Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) === A biotina (vitamina B7) pode ser acoplada a diferentes tipos de moléculas e, ainda assim, ser reconhecida seletivamente pelas proteínas avidina e estreptavidina devido à alta constante de afinidade que existe entre elas (Ka = 1,0×1015 L mol-1). Assim, essa interação proporciona excelente aumento na sensibilidade de várias análises; o que leva ao desenvolvimento métodos analíticos para determinação de diferentes compostos que são biotinilados. O uso de materiais biológicos, como anticorpos ou proteínas, em análises de rotina se torna muitas vezes dispendioso e, devido à baixa estabilidade das biomoléculas em condições adversas às mesmas, iniciou-se a síntese de materiais que possam mimetizar as interações biológicas de reconhecimento; o que vem sendo feito com sucesso pelos polímeros molecularmente impressos (MIP). Esses polímeros apresentam vantagens em relação às biomoléculas por possuirem baixo custo, fácil preparação e alta resistência mecânica e térmica. Assim, esta dissertação aborda a síntese, caracterização, otimização e aplicação de diferentes MIP que possuem biotina como molécula alvo. Os estudos iniciais focaram na síntese do MIP magnético (MMIP) com acesso restrito (RAMIP) para realizar exclusão proteica pela modificação do polímero com albumina do soro bovino (BSA) e polietileno glicol (PEG). Enquanto o RAMIP recoberto com BSA não apresentou bons resultados nos experimentos, o RAMIP recoberto com PEG, após otimização, apresentou resultados altamente satisfatórios na exclusão proteica (com valores na faixa de 98 até 99,4 % de exclusão) e bons resultados na religação da biotina (2,0 mg de biotina por grama de polímero). A segunda parte do trabalho foi focada no estudo da influência do tipo de impressão molecular (não covalente e semicovalente) na capacidade do reconhecimento seletivo dos MMIP. Para isso, foi sintetizado previamente o complexo analito-monômero (por meio de uma ligação covalente entre a biotina e o álcool alílico como monômero funcional). Esse MMIP foi submetido aos ensaios de reconhecimento da biotina utilizando-se interações não covalente, sendo denominado de MMIP semicovalente; cujos resultados foram comparados com MMIP para biotina não covalente otimizado previamente. O MMIP semicovalente apresentou uma constante de afinidade pela biotina de 5,9×104 L mol-1, enquanto para o MMIP não covalente foi de 2,4×103 L mol-1. Finalmente, o MIP e o MMIP para biotina (sintetizados via não covalente) foram aplicados em ensaios biomiméticos utilizando as técnicas de ELISA e Fluxo Lateral. Nos ensaios ELISA avaliou-se a capacidade de reconhecimento do MMIP pela biotina-HRP e DNA biotinilado (das bactérias E. coli e Salmonella). Para biotina-HRP, o MMIP apresentou retenção (na faixa de 5,0 até 2500 ng mL-1), e uma alta intensidade de sinal. Para o DNA biotinilado, de ambas bactérias, o MMIP mostrou maior retenção do amplicon quando comparado ao NIP. A aplicação do MIP nos dispositivos de Fluxo Lateral é inédita. Assim, após a otimização de todos os parâmetros para desenhar a linha de teste contendo MIP (como solvente, massa, soluções, etc.), avaliou-se a resposta do sistema para diferentes moléculas biotiniladas: para BSA-biotina e o corante Atto 655-biotina os resultados não foram satisfatórios; para biotina-HRP, biotina 4-fluoresceína e os amplicons, MIP apresentou boa resposta no reconhecimento seletivo. Assim, os MIP mostraram-se promissores no desenvolvimento de ensaios biomiméticos. === Biotin (vitamin B7) can be attached with different types of molecules and still be selectively recognized by avidin/streptavidin proteins due to the high affinity constant between them (Ka = 1,0×1015 L mol-1). Thus, this interaction provides an excellent increase in the sensitivity of analyzes; which leads to the development of analytical methods for the determination of different biotinylated compounds. The use of biological materials, such as antibodies or proteins, in analyzes is often expensive and has low stability of biomolecules under adverse conditions, which has led to the synthesis of materials that can mimic the biological interactions of recognition; which has been successfully made by molecularly printed polymers (MIP). These polymers have advantages over biomolecules because they have low cost, easy preparation and high mechanical and thermal resistance. Thus, this dissertation explores the synthesis, characterization, optimization and application of different MIP that has biotin as the target molecule. Initial studies focused on the synthesis of magnetic MIP (MMIP) with restricted-access (RAMIP) to evaluate protein exclusion by modifying the polymer with bovine serum albumin (BSA) and polyethylene glycol (PEG). While RAMIP coated with BSA didn’t present good results in the experiments, the RAMIP coated with PEG, after optimization, presented highly satisfactory results in protein exclusion (with values ranging from 98 to 99.4% of protein exclusion) and good results in the rebiding of biotin (2.0 mg of biotin per gram of polymer). The second part of the work was focused on the study of influence of molecular imprinting (non-covalent and semi-covalent) on the capacity of the selective recognition of MMIP. For this, the analyte-monomer complex was previously synthesized (by a covalent bond between biotin and allyl alcohol as functional monomer). This MMIP was submitted to the biotin recognition assays using non-covalent interactions, being nominated as semi-covalent MMIP; whose results were compared with non-covalent biotin MMIP previously optimized. The semi-covalent MMIP had an affinity constant for biotin of 5,9×104 L mol-1, while for non-covalent MMIP it was 2,4×103 L mol-1. Finally, MIP and MMIP for biotin (synthesized via non-covalent) were applied in biomimetic assays using ELISA and Lateral Flow techniques. In the ELISA assays, it was evaluated MMIP recognition capacity by biotin-HRP and biotinylated DNA (of E. coli and Salmonella bacteria). For biotin-HRP, MMIP showed good retention results (in the range of 5.0 to 2500 ng mL-1), and good signal intensity. For biotinylated DNA of both bacteria, MMIP showed higher retention of the amplicon when compared to MNIP. The application of MIP in Lateral Flow devices it wasn’t reported before. Thus, after optimizing all the parameters to design the test line containing MIP (as solvent, mass, solutions, etc.), the system's response to different biotinylated molecules was evaluated: for BSA-biotin and Atto 655-biotin dye the results were not satisfactory; for biotin-HRP, biotin 4-fluorescein and the amplicons MIP showed good selective recognition response. Thus, the imprinted polymers are promising materials in the development of biomimetic assays. === FAPESP: 2015/04367-1 === FAPESP: 2016/07250-0