Avaliação do peptídeo LL-37 em contato com células-tronco da polpa dentária

• Main Author: Milhan, Noala Vicensoto Moreira [UNESP]
• Other Authors: Universidade Estadual Paulista (UNESP)
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Estadual Paulista (UNESP) 2017
• Subjects: LL-37; Peptídeo antimicrobiano; Biocompatibilidade; Diferenciação; Células-tronco; Polpa dentária; Antimicrobial peptide; Biocompatibility; Differentiation; Stem cells; Dental pulp
• Online Access: http://hdl.handle.net/11449/149791

Submitted by NOALA VICENSOTO MOREIRA MILHAN null ([e-mail]) on 2017-03-14T15:32:19Z No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_biblioteca_pdf_com ficha..pdf: 9569489 bytes, checksum: 1675ea8facc1f735605660b0b01b8cad (MD5) === Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira ([e-mail]) on 2017-03-20T22:29:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 milhan_nvm_dr_sjc.pdf: 9569489 bytes, checksum: 1675ea8facc1f735605660b0b01b8cad (MD5) === Made available in DSpace on 2017-03-20T22:29:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 milhan_nvm_dr_sjc.pdf: 9569489 bytes, checksum: 1675ea8facc1f735605660b0b01b8cad (MD5) Previous issue date: 2017-01-16 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) === O peptídeo LL-37 (catelicidina derivada de humano), é liberado por algumas células humanas e capaz de neutralizar os tecidos com lipopolissacarídeo (LPS), além de atrair células da polpa, e induzir a angiogênese, características que o tornam um possível adjunto para a regeneração do complexo dentino-pulpar. O objetivo desse trabalho foi avaliar in vitro a biocompatibilidade do peptídeo LL-37 nas concentrações de 5 e 10 μg/mL, e sua possível atuação na diferenciação de células-tronco da polpa dentária (DPSC) para odontoblastos- like. Com esse propósito, foram avaliados: (a) a citotoxicidade, pelo teste MTT; (b) a genotoxicidade, através do ensaio do micronúcleo; (c) a produção e quantificação de óxido nítrico; (d) as fases do ciclo celular, por citometria; (e) a expressão de alguns genes associados à formação de tecido mineralizado, através do teste qRT-PCR; (f) o conteúdo de proteína total; (g) a atividade de fosfatase alcalina (ALP); e (h) a produção de sialofosfoproteína dentinária (DSPP), pelo ensaio imunoenzimático ELISA. Foi observado que as concentrações de 5 e 10 μg/mL de LL-37 não foram citotóxicas e ainda aumentaram, em geral, a viabilidade celular (p<0,05), sendo que os maiores valores de absorbância foram observados no 3° dia de contato. As concentrações testadas também não induziram genotoxicidade, após 7 dias de contato, tendo sido genotóxico apenas o grupo controle positivo (EMS) (p<0,05). Ainda, não foi observado diferença estatisticamente significativa na produção de nitrito, pelas células expostas ao LL-37 após 7 dias, em ambas as concentrações. A análise do ciclo celular, evidenciou maior porcentual de células na fase G0/G1, em todos os grupos (p<0,05). Quando estes foram comparados, foi observado maior quantidade de células na fase G0/G1 na concentração de 10 μg/mL de LL- 37 comparada ao grupo controle (p<0,05). Por outro lado, o grupo controle exibiu mais células na fase G2 e em mitose (M) que os grupos tratados com 5 e 10 μg/mL de LL-37 (p<0,05), e mais células na interfase (S) que o grupo tratado com 10 μg/mL de LL-37 (p<0,05). A análise da expressão gênica demonstrou que não houve aumento de expressão dos genes fosfatase alcalina, osteocalcina, osteopontina e Runx2 após tratamento com ambas as concentrações do peptídeo, no 3° dia. Além disso, não foi observado diferença estatisticamente significativa na ALP nos grupos tratados e controle, após 3 e 14 dias, enquanto o conteúdo de proteína total foi maior aos 14 dias nos grupos tratados com LL-37 (p<0,05). Ainda, aos 3 dias, a produção da proteína DSPP foi maior no grupo tratado com 10 μg/mL de LL-37 (p<0,05). Com base nesses resultados, pode-se concluir que o LL-37 é biocompatível nas concentrações testadas nesse trabalho, e ainda aumenta o número de células viáveis, principalmente em período inicial. Além disso, aos 3 dias, na concentração de 10 μg/mL, ele retarda o ciclo celular e aumenta a expressão da proteína DSPP, além de aumentar a síntese proteica aos 14 dias, o que indica que esse peptídeo pode desempenhar algum tipo de função na diferenciação odontoblástica. === The LL-37 peptide (human derived cathelicidin) is released by some human cells and able of neutralizing the tissues that present lipopolysaccharide (LPS), as well as, attracts pulp cells and induces angiogenesis; characteristics that makes it a possible adjunct for regeneration of the dentin-pulp complex. The aim of this study was evaluate in vitro the biocompatibility of LL-37 in the concentrations of 5 and 10 μg/mL, and its possible performance in the differentiation of dental pulp stem cells (DPSC) into odontoblasts-like cells. For this purpose, it was evaluated: (a) the cytotoxicity by MTT assay; (b) the genotoxicity by the micronucleus test; (c) the production and quantification of nitric oxide; (d) the cell cycle, by flow cytometry; (e) the expression of genes associated with the mineralization by qRT-PCR; (f) the total protein content; (g) the alkaline phosphatase activity (ALP); and (h) the production of dentine sialofosfoprotein (DSPP) by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). It was observed that the concentrations of 5 and 10 μg/ml of LL-37 were not cytotoxic, in addition to they increased, in general, the cell viability (p<0,05). Moreover, higher absorbance values were observed on 3rd day of contact. After 7 days, the tested concentrations also did not induce genotoxicity, (p<0,05); only the positive control group (EMS) was genotoxic (p<0.05). Furthermore, there was not statistical significance in the nitrite production by the cells exposed to LL-37 for 7 days, in both concentrations. The cell cycle test showed higher percentage of cells in the phase G0/G1 in all groups (p<0.05). When they were compared, it was noticied that concentration of 10 ug/ml of LL-37 arrested the cells in G0/G1 compared to the control group (p<0.05). On the other hand, the control group, exhibited higher amount of cells in G2 and mitosis (M) than the others (p<0.05) and also higher number of cells in interfase (S) than the group treated with 10 μg/mL of LL-37 (p<0.05). On the 3rd day, the analysis of gene expression demonstrated no increase in the expression of the genes alkaline phosphatase, osteocalcin, osteopontin and Runx2, after treatment with both peptide concentrations. Furthermore, it was not observed statistical significance in the ALP in the treated and control groups after 3 and 14 days, while total protein content was higher in the groups treated with LL-37, at 14 days (p<0.05). On the 3rd day, the production of DSPP protein was higher in the group treated with 10 μg/mL of LL-37 (p<0.05). Based on these results, it can be concluded that LL-37 is biocompatible at these concentrations and increases the number of viable cells, especially in the initial period. Moreover, on the 3rd day, the concentration of 10 μg/mL arrests the cell cycle, and increases the expression of DSPP protein, in addition to raising the protein content at 14 days, which indicates that this peptide may present some kind of function in the odontoblastic differentiation.