Enucleação química de ovócitos bovinos e reprogramação celular por fatores definidos em murinos

• Main Author: Moura, Marcelo Tigre
• Other Authors: Lucci, Carolina Madeira
• Language: Portuguese
• Published: 2011
• Subjects: Bovino - reprodução; Clonagem; Transferência nuclear; Células-tronco - veterinária
• Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/9539

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2011. === Submitted by Shayane Marques Zica ([e-mail]) on 2011-10-27T18:57:45Z No. of bitstreams: 1 2011_MarceloTigreMoura.pdf: 6193475 bytes, checksum: 12353daa4f10fb76887ace85228c8ceb (MD5) === Approved for entry into archive by Repositorio Gerência([e-mail]) on 2011-10-27T19:42:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_MarceloTigreMoura.pdf: 6193475 bytes, checksum: 12353daa4f10fb76887ace85228c8ceb (MD5) === Made available in DSpace on 2011-10-27T19:42:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_MarceloTigreMoura.pdf: 6193475 bytes, checksum: 12353daa4f10fb76887ace85228c8ceb (MD5) === O processo de diferenciação celular foi por muito tempo considerado progressivo e irreversível. O desenvolvimento da clonagem por transferência nuclear e da indução da pluripotência por fatores definidos (Oct4, Sox2, cMyc, e Klf4) demonstrou inequivocamente que células somáticas podem ser reprogramadas para um estado indiferenciado. No entanto, essas tecnologias permanecem pouco eficientes devido a fatores técnicos e biológicos. A enucleação dos ovócitos representa um dos principais fatores limitantes da transferência nuclear, enquanto que a integração dos transgenes no genoma durante a indução da pluripotência pode afetar negativamente o fenótipo das células. Por isso, os objetivos do presente trabalho foram: aprimorar a enucleação química de ovócitos pela actinomicina D e investigar um mecanismo que permita reprogramar para pluripotência sem Oct4 exógeno, ao compensar a atividade do transgene com moléculas. A investigação da enucleação por actinomicina D permitiu eliminar a toxidez da abordagem durante a maturação dos ovócitos, aumentar a eficiência do procedimento e reduzir drasticamente o período de incubação com a actinomicina D. Diferentes abordagens in vitro e in vivo permitiram determinar que a principal limitação do desenvolvimento embrionário após a enucleação pela actinomicina D é a presença dos cromossomos expostos a actinomicina D dentro gameta. A ativação do gene Nr5a2 foi testada como mecanismo para substituir o Oct4 exógeno na indução da pluripotência, baseandose na importância desse receptor nuclear na regulação do Oct4 durante o desenvolvimento. A expressão forçada do Nr5a2 não aumentou a eficiência da reprogramação com Oct4, Sox2, e Klf4 em fibroblastos, e em conjunto com Sox2 e Klf4 apenas não resultou em células reprogramadas. As tentativas de ajustar a estequiometria das partículas virais e de elevar a expressão endógena do Nr5a2 pelo uso de agonistas também não foram bem sucedidas. Esforços mais recentes utilizando hepatócitos podem determinar se existem limitações tecido-específicas. Apesar das evidências recentes na literatura em suporte ao modelo, ainda não foi possível repetir tais resultados. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT === Cell differentiation has long been considered a progressive and irreversible process. The development of cloning by nuclear transfer and induced pluripotency by defined factors (Oct4, Sox2, cMyc, and Klf4) demonstrated inequivocally that somatic cells can be reprogrammed to an undifferentiated state. However, both technologies hold low efficiencies due to technical and biological factors. The enucleation of oocytes represents one of the main limiting factors for nuclear transfer, while the integration of reprogramming vectors in the genome during the induction of pluripotency can negatively affect cell phenotype. Due to these facts, the objectives of the present research were: to improve oocyte chemical enucleation by actinomycin D and to investigate a mechanism that would allow reprogramming in the absence of exogenous Oct4, by replacing the transgene with small molecules. The investigation of oocyte enucleation by actinomycin D confered with the possibility to eliminate the toxic effect of the approach on oocyte maturation, to increase enucleation efficiency and drastically reduce incubation period with the inhibitor. Different in vitro and in vivo approaches altogether allowed the conclusion that the main limiting factor to embryonic development after enucleation by actinomycin D is the presence of cromossomes exposed to the inhibitor inside the oocyte. The induction of Nr5a2 expression was tested as a possible mechanism to replace exogenous Oct4 during reprogramming to pluripotency based on upstream roles of the nuclear receptor on Oct4 levels during development. The ectopic expression of Nr5a2 did not increase reprogramming efficiency with Oct4, Sox2, and Klf4 in fibroblasts, and concomitant with Sox2 and Klf4 only did not yield reprogrammed cells. Fine-tuning of viral stochiometry and atempts to induce endogenous expression of Nr5a2 by agonists were unsuccessful. Recent efforts with hepatocytes might shed some light on possible cell type specific limitations. In spite of recent literature in accordance with this model, it has been challeging to reproduce such results.