Contribuição do segmento VH e da CDRH3 no reconhecimento antigênico de ácidos nucléicos

• Main Author: Guedes, Leonardo
• Other Authors: Maranhão, Andréa Queiroz
• Language: Portuguese
• Published: 2010
• Subjects: Imunoglobulinas; Anticorpos; Biologia molecular
• Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/4575

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. === Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos ([e-mail]) on 2010-03-30T15:15:38Z No. of bitstreams: 1 2009_LeonardoGuedes.pdf: 5624272 bytes, checksum: 75f7b4a1facc94065376aad00f058fb4 (MD5) === Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro([e-mail]) on 2010-05-12T14:36:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_LeonardoGuedes.pdf: 5624272 bytes, checksum: 75f7b4a1facc94065376aad00f058fb4 (MD5) === Made available in DSpace on 2010-05-12T14:36:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_LeonardoGuedes.pdf: 5624272 bytes, checksum: 75f7b4a1facc94065376aad00f058fb4 (MD5) Previous issue date: 2009 === As imunoglobulinas são moléculas com capacidade de ligação a uma grande diversidade de antígenos. Estudos de variabilidade mostram que três regiões em cada cadeia variável, leve (L) e pesada (H), apresentam um maior grau de variabilidade, sendo por isso denominadas Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR). Dentre essas, a CDR3 de ambas cadeias (H e L) é a que apresenta maior variabilidade. O objetivo deste trabalho é estudar anticorpos com capacidade de reconhecimento de ácidos nucléicos. Análises em bancos de dados revelaram que dentre as diversas famílias de genes que codificam as cadeias variáveis pesadas de camundongos, a pequena família VH10 destaca-se por ter sido identificada principalmente em anticorpos anti-DNA. Essa observação nos levou a postular que determinantes estruturais codificados por segmentos da família VH10 poderiam estar envolvidos nesse reconhecimento. Assim, nesse trabalho, construíu-se bibliotecas de scFvs de camundongos apresentadas na superfície de fagos filamentosos, contendo CDRH3s variáveis, no contexto de segmentos gênicos germinais da família VH10 e da família VH4 (que não apresenta nenhum Ac descrito como ligante a ácidos nucléicos depositado em banco de dados). A abordagem experimental consistiu basicamente na comparação do grau de variabilidade das CDRH3s selecionadas pela capacidade de reconhecimento a DNA de fita simples utilizando-se o procedimento de seleção (biopanning) preconizado na técnica de Phage Display As bibliotecas apresentavam tamanhos na ordem de 107 diferentes scFvs. Elas eram selecionadas pela capacidade de ligação a oligodT - celulose e os títulos de entrada e de saída foram obtidos em três ciclos de seleção. Foram realizados imunoensaios com as partículas virais selecionadas dos ciclos 2 e 3, tanto para a detecção da expressão dos scFvs como também para a verificação da capacidade de reconhecimento ao antígeno (oligodT - biotinilado). Os resultados obtidos com a análise de clones aleatoriamente escolhidos do ciclo 2 e 3 revelaram 12 sequências de CDR3Hs associadas a ligação a ácidos nucléicos e dessas, 9 são provenientes da família VH10 e 3 da família VH4. As três sequências obtidas no contexto de VH4 também estão presentes no contexto VH10. Os resultados sugerem que scFvs no contexto da família VH10, podem apresentar uma maior variabilidade CDR3Hs para o reconhecimento de ácidos nucléicos do que aqueles que apresentam o segmento da famíliaVH4, corroborando a hipótese de que determinantes estruturais codificados pelo segmento gênico VH10 participam do processo de reconhecimento antigênico. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT === The immunoglobulins are molecules with the capacity to recognize a variety of antigens. Variability studies show that three regions in each variable chain, light (L) and heavy (H), have a greater degree of variability and is therefore called Complementarity Determinants Regions (CDR). Among these, the CDR3 of both chains (H and L) are the ones that show the greatest variabilities. The aim of this work is study the antibodies able to recognize nucleic acids. Analysis in databases revealed that among the different families that are gene that encode the murine variable heavy chains, the small VH10 family stands out in terms of such kind of antigen recognition. This observation led us to postulate that structural determinants encoded by the V segment of the VH10 family could be specially involved in this binding ability. Thus, we built two scFvs phage display libraries, containing variable CDRH3, in the context of germinal V gene from family VH10 and the family VH4 (which presents no antibody described as ligand to nucleic acid in databank). The experimental approach was basically the biopanning of phages from those two libraries, using oligo-dT celulose as ligand. After three selection rounds, phages from round 2 and 3 were analyzed in terms of CDR3H composition and the ability to bind to the antigen in immunoassays.The analysis of randomly selected clones revealed 12 sequences of CDR3Hs able to bind to nucleic acids. From these, 9 were from the VH10 family and 3 were VH4 phages. The three sequences obtained in the context of VH4 were also present in VH10 phages. The results suggested that VH10 scFvs may allow greater CDR3H variability than VH4 ones, corroborating the hypothesis that structural determinants encoded by the V gene segment from VH10 contributes significatively for the recognition of nucleic acids.