| Summary: | Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. === Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-03-29T13:47:46Z
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Previous issue date: 2009 === Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva, entomopatogênica, que se caracteriza pela presença de inclusões cristalinas denominadas de #-endotoxinas ou proteínas Cry. Essas proteínas podem ser altamente tóxicas para insetos suscetíveis, não apresentando atividade para outros organismos. Alguns sistemas de expressão vêm sendo utilizados para expressar proteínas Cry com a finalidade de aumentar a sua toxicidade para diversas ordens de insetos. Os baculovírus são vírus de insetos que têm sido muito utilizados como vetores de expressão de genes heterólogos em células de insetos, devido principalmente à presença de promotores fortes que permitem altos níveis da proteína heteróloga na fase tardia da infecção. Neste trabalho, foram clonados genes cry (cry2Aa e cry11A) isolados das estirpes de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki S447 e subsp. israelensis S1806, respectivamente, no genoma do baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), por transposição sítio-específica, gerando os vírus vAcCry2Aa e vAcCry11A. A avaliação da expressão bem como a presença do transcrito foi realizada por RT-PCR. As proteínas heterólogas Cry2Aa e Cry11A foram analisadas em gel SDS-PAGE 12%, revelando a presença de bandas de aproximadamente 65 kDa e 70 kDa, respectivamente. A toxicidade das proteínas heterólogas foi testada para larvas de inseto das ordens Lepidoptera e Diptera. A proteína heteróloga Cry2Aa apresentou uma CL50 1,036 $g/mL para larvas de segundo instar de Anticarsia gemmatalis , enquanto Cry11A mostrou ser bastante tóxica para larvas de segundo instar de Aedes aegypti com CL50 de 53,3 ng/mL. A presença de cristais derivados da proteínas heteróloga Cry2Aa só foi evidenciada nos extratos de lagartas infectadas com os vírus recombinantes. A análise ultraestrutural da proteína heteróloga Cry2Aa purificada a partir dos extratos das larvas de terceiro instar infectadas com o vírus recombinante vAcCry2Aa mostrou a presença de grandes cristais na forma cubóide Neste trabalho foi possível avaliar que o baculovírus é um bom vetor de expressão de proteínas Cry. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT === Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram positive, entomopathogenic bacteria that produces crystalline inclusions called -endotoxins or Cry proteins. These proteins are highly toxic to susceptible insects, not showing activity against others organisms. Some expression systems have been used to express crystal proteins with the aim to increase their toxicity for several insect orders. Baculoviruses are insect viruses that have been widely used as expression vectors of heterologous proteins in insect cells, mainly due to the presence of strong promoters that allow high levels of expression of the heterologous protein during the late phase of virus infection. In this work, cry genes (cry2Aa and cry11A) from B. thuringiensis subsp. Kursaki S447 and subsp. israelensis S1806, respectively, were introduced into the genome of the baculovirus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), by site-specific transposition, generating the recombinant viruses vAcCry2Aa and vAcCry11A. Transcription of the heterologous genes were confirmed using mRNA from recombinant viruses infectedinsect cells (72 h p.i) by RT-PCR . The heterologous Total extracts from Spodoptera frugiperda infected with the recombinant viruses (vAcCry2Aa and vAcCry11A) were analyzed by SDS-PAGE, which detected the presence of polypeptides around 65 kDa and 70 kDa, respectively. Bioassays, using the heterologous proteins showed that Cry2Aa had toxicity to second instar Anticarsia gemmatalis larvae with a LC50 of 1.03 $g/mL and that Cry11A had toxicity to second instar Aedes aegypti larvae (Cry11A) with a LC50 of 53.3 ng/mL. Cuboid-shaped protein crystals (Cry2Aa) were observed only in vAcCry2Aa S. frugiperda infected-extracts by light and scanning electron microscopy. This work confirms the utility of the baculovirus expression system for the efficient expressionof Cry proteins.
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