Caracterização do carlavírus Melon yellowing-associated virus e do polerovírus Cucurbit aphid-borne yellows virus em meloeiro

• Main Author: Costa, Thiago Marques
• Other Authors: Nagata, Alice Kazuko Inoue
• Language: Portuguese
• Published: 2018
• Subjects: Vírus de plantas; Melão; Vírus de plantas - aspectos genéticos; Mosca-branca; Fitopatologia
• Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/32803

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2018. === Submitted by Fabiana Santos ([e-mail]) on 2018-10-05T18:17:37Z No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoMarquesCosta.pdf: 2214752 bytes, checksum: 27606d84195a210bc279e6daf9613382 (MD5) === Approved for entry into archive by Fabiana Santos ([e-mail]) on 2018-10-09T20:22:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoMarquesCosta.pdf: 2214752 bytes, checksum: 27606d84195a210bc279e6daf9613382 (MD5) === Made available in DSpace on 2018-10-09T20:22:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoMarquesCosta.pdf: 2214752 bytes, checksum: 27606d84195a210bc279e6daf9613382 (MD5) Previous issue date: 2018-10-09 === Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ). === A região Nordeste é a maior produtora de melão no Brasil, contribuindo com cerca de 90% da produção nacional. Os Estados do Rio Grande do Norte e Ceará juntos produzem desde 2010 cerca de 500 mil toneladas/ano em 21.000 ha de área plantada, sendo os maiores estados produtores do país. O Brasil ocupa o 11º lugar no ranking mundial de produção de melão, sendo este fruto um dos mais exportados nos últimos anos no país. No Brasil, as viroses destacam-se entre os principais problemas fitossanitários que afetam as cucurbitáceas, causando redução na qualidade dos frutos e perda significativa na produção. Os principais vírus que infectam o meloeiro são os potyvírus, comovírus, cucumovírus, tospovírus e carlavírus. O “Amarelão do meloeiro” é considerado a principal doença dessa cultura. Essa doença é caracterizada por apresentar forte clorose nas folhas mais velhas e é associada, até então, ao carlavírus Melon yellowing-associated virus (MYaV) como o agente causador. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os vírus potenciais candidatos a agente causador do “Amarelão do meloeiro”. Um conjunto de amostras de meloeiro apresentando sintoma de “Amarelão do meloeiro” foi coletado em Mossoró (RN) e Juazeiro (BA) e os ácidos nucleicos purificados foram sequenciados utilizando a tecnologia de Sequenciamento de Nova Geração (NGS) pela plataforma Illumina HiSeq 2000. Foram identificadas em alta frequência sequências com alta identidade ao genoma do carlavírus Melon yellowing-associated virus (MYaV) e ao polerovírus Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV). Foi elaborada a hipótese de que um desses dois vírus, ou ambos, seja o vírus causador da doença e, portanto, foram caracterizados neste estudo. O isolado de MYaV caracterizado molecularmente foi proveniente de Mossoró sendo denominado isolado M22-MYaV e os isolados de CABYV denominados CABYV-M3 e CABYV-JMB1, de Ceará (CE, perto da cidade de Mossoró) e Juazeiro (BA), respectivamente. A determinação do genoma completo foi realizada a partir de NGS e por sequenciamento pelo método Sanger. O genoma do MYaV possui 9073 bases e codifica seis proteínas: RdRp (ca. 6,2 kb), TGB1 (ca. 0,7 kb), TGB2 (ca. 0,3 kb), TGB3 (ca. 0,2 kb), CP (ca. 1 kb) e NaBp (ca. 0,4 kb). A análise filogenética utilizando a sequência da proteína de replicação (RdRp) do MYaV mostrou que o vírus apresenta maior relacionamento com o carlavírus Sweet potato yellow mottle virus (59,8%), confirmando a classificação do MYaV dentro do gênero Carlavirus. O genoma dos isolados M3 e JMB1 de CABYV é de cerca de 5,7 kbases, codificando sete ORFs: ORF0 (0,7 kb), ORF1 (ca. 1,8 kb), ORF2 (ca. 1,3 kb) , ORF3 (ca. 0,6 kb), ORF3a (ca. 0,1 kb), ORF4 (ca. 0,7 kb) e ORF5 (ca. 0,1 kb). O genoma dos dois isolados de CABYV apresenta 96,8% de identidade em nucleotídeo entre si e 73,7% com a sequência do isolado CABYV-N da França (X76931). A baixa identidade de sequência entre os isolados brasileiros e o francês se deve a uma região de recombinação na extremidade 3’ do genoma compreendendo as regiões que codificam a capa proteica (CP: ORF3 e ORF5) e proteína de movimento (MP: ORF4). O major parent do recombinante foi identificado como CABYV na análise, mas o minor parent não foi identificado dentro do conjunto de sequências de vírus utilizado. A análise filogenética e do relógio molecular sugere que os isolados M3 e JMB1 são possivelmente originários da França, tendo passado anteriormente pela Espanha e Taiwan. Um ensaio em condições controladas demonstrou que o isolado brasileiro de CABYV é eficientemente transmitido por moscas-brancas (Bemisia tabaci biótipo B), apesar de ser classificado como um polerovírus que é tipicamente transmitido por afídeos. Foi possível produzir antissoro específico ao isolado brasileiro de CABYV, que se mostrou útil para testes de detecção por DAS-ELISA. Este estudo apresenta o genoma completo do MYaV e a caracterização molecular e filogenética de novos isolados de CABYV em meloeiro no Brasil e mostra evidências que um membro da família Luteoviridae pode ser transmitido por Bemisia tabaci. === The Northeast region is the largest melon producer in Brazil, accounting for around 90% of the national production. Since 2010, together, the states of Rio Grande do Norte and Ceará have produced around 500,000 tons / year in 21,000 hectares of planted area, being the largest producing state in the country. Brazil occupies the 11th place in the world ranking of melon production, being one of the most exported fruit in recent years. In Brazil, viruses are among the main phytosanitary problems affecting cucurbits, causing a reduction in fruit quality and a significant loss of production. The major viruses that infect melon plants are potyviruses, cucumoviruses, tospoviruses and carlaviruses. "Amarelão do meloeiro”, meaning melon severe yellowing, is considered as the main disease of this crop. This disease is characterized by the occurrence of strong chlorosis in the older leaves of infected plants and is associated with Melon yellowing-associated virus (MYaV) as the causative agent. The objective of this work was to characterize potential virus candidates for the causative agent of "Amarelão do meloeiro". A set of melon samples showing "Amarelão do meloeiro" symptom was collected in Mossoró (state of Rio Grande do Norte) and Juazeiro (Bahia) and purified nucleic acids were sequenced using the Next Generation Sequencing (NGS) technology by the Illumina HiSeq 2000 platform. Sequences of the genome of the carlavirus Melon yellowing-associated virus (MYaV) and the polerovirus Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV) were found in high frequency. It was hypothesized that one of these two viruses, or both, is the virus that causes the disease and, therefore, were characterized in this study. Molecular characterized MYaV isolate was derived from Mossoró being named M22-MYaV isolate and the CABYV isolates were named CABYVM3 and CABYV-JMB1, collected in Ceará (near the city of Mossoró) and Juazeiro (Bahia), respectively. Determination of the complete genome sequence was performed by NGS and by sequencing by the Sanger method. MYaV genome has 9073 bases and encodes six proteins: RdRp (ca. 6.2 kb), TGB1 (ca. 0.7 kb), TGB2 (ca. 0.3 kb), TGB3 (ca. 0.2 kb), CP (ca. 1 kb) and NaBp (ca. 0.4 kb). Phylogenetic analysis using the MYaV replication protein sequence (RdRp) showed that the virus was closely related to the carlavirus Sweet potato yellow mottle virus (59.8%), confirming the classification of MYaV within the genus Carlavirus. The genome of the CABYV M3 and JMB1 isolates is ~ 5.7 kbases, encoding seven ORFs: ORF0 (0.7 kb), ORF1 (ca. 1.8 kb), ORF2 (ca. ORF3 (ca. 0.6 kb), ORF3a (ca. 0.1 kb), ORF4 (ca. 0.7 kb) and ORF5 (ca. 0.1 kb). The genome of the two CABYV isolates shares 96.8% nucleotide identity to each other and 73.7% to the CABYV-N isolate from France (X76931). The low sequence identity between the Brazilian and French isolates is due to a region of recombination at the 3' end of the genome comprising the regions encoding the coat protein (CP: ORF3 and ORF5) and movement protein (MP: ORF4). The major parent of the recombinant was identified as CABYV in the analysis, but the minor parent was not identified within the set of virus sequences used. Phylogenetic and molecular clock analyses suggest that the M3 and JMB1 isolates are possibly from France, having previously passed through Spain and Taiwan. A transmission test performed under controlled conditions has demonstrated that CABYV Brazilian isolate is efficiently transmitted by whiteflies (Bemisia tabaci biotype B), although it is classified as a polerovirus, that is typically transmitted by aphids. It was possible to produce a specific antiserum to the Brazilian CABYV isolate, which proved useful for DAS-ELISA detection tests. This study presents the complete genome of MYaV and the molecular and phylogenetic characterization of new isolates of CABYV in melon in Brazil and shows evidence that a member of the family Luteoviridae can be transmitted by Bemisia tabaci.