Caracterização estrutural e funcional de proteínas de camada S de Haloferax volcanii

• Main Author: Oliveira, Thiago Rodrigues de
• Other Authors: Kyaw, Cynthia Maria
• Language: Portuguese
• Published: 2018
• Subjects: Proteínas - estrutura molecular; Archaea; Expressão gênica; Biotecnologia
• Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/32598

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. === Submitted by Fabiana Santos ([e-mail]) on 2018-09-03T20:38:24Z No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoRodriguesdeOliveira.pdf: 3205780 bytes, checksum: 3bcc450ab74953bdffd4e6c59d584dc0 (MD5) === Approved for entry into archive by Fabiana Santos ([e-mail]) on 2018-09-11T16:56:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoRodriguesdeOliveira.pdf: 3205780 bytes, checksum: 3bcc450ab74953bdffd4e6c59d584dc0 (MD5) === Made available in DSpace on 2018-09-11T16:56:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_ThiagoRodriguesdeOliveira.pdf: 3205780 bytes, checksum: 3bcc450ab74953bdffd4e6c59d584dc0 (MD5) Previous issue date: 2018-09-03 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). === A presença de uma camada proteica de superfície (camada S) é comum em organismos procarióticos. As proteínas que compõem essa camada apresentam a propriedade de se auto-organizar em arranjos simétricos estáveis, que as confere um alto potencial biotecnológico. Apesar de presente em quase todas as archaeas, existem poucos relatos do uso de proteínas de camada S desses organismos em estudos aplicados. Além disso, os estudos descrevendo a estrutura de proteínas desse tipo são escassos. Assim, esse trabalho tem o objetivo de caracterizar estruturalmente as proteínas de camada S da archaea halófila Haloferax volcanii, utilizá-las para a construção de envelopes celulares biomiméticos para o estudo de membranas e a expressão dessa proteína em E. coli para construção de fusões gênicas de interesse. As proteínas foram obtidas a partir da cultura de células de H. volcanii e caracterizadas por ensaios de espalhamento de luz dinâmico, dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. Microscopia eletrônica de transmissão foi utilizada para observar a formação do arranjo cristalino das proteínas purificadas, bem como de envelopes celulares de H. volcanii. Foram produzidas monocamadas lipídicas por Langmuir-Blodgett utilizando os lipídios DPPE, DPPC e DPhPE. A estrutura secundária da proteína é afetada pelo pH, de maneira que uma maior quantidade de folhas beta foi detectada em valores mais altos. Esse mesmo fator influencia também a sua estrutura terciária, de maneira que em valores mais alcalinos as regiões próximas aos resíduos de triptofano da proteína interagem mais com o meio. No entanto, ensaios de espalhamento de luz dinâmico indicaram formação de oligômeros em todos os pHs testados, havendo picos monodispersos, indicando a capacidade de cristalização da proteína em todas as condições. No entanto, imagens de microscopia revelam que os arranjos formados nessas condições não estão de acordo com o normalmente observado na superfície celular desse organismo, algo que foi somente possível em condições de alta salinidade. A concentração de íons de sódio, magnésio e cálcio no meio afeta a estrutura secundária e terciária da proteína, influenciando assim a sua propriedade de auto-arranjo. Nos ensaios de Langmuir-Blodgett, foi observada a cristalização das proteínas sobre as diferentes superfícies lipídicas, sugerindo assim um possível potencial no uso dessas proteínas para produção de envelopes celulares artificiais. Foi também possível a expressão de proteínas de camada S de H. volcanii em E. coli. === The presence of a protein surface layer, known as the S-layer, is commonly found in prokaryotic cell envelopes. This layer is composed of proteins that self-assemble into a paracrystalline surface structure, a property that has been extensively used in biotechnological research. Despite its detection in almost all archaea described to date, there are very few reports in the literature using these proteins for applied purposes. Furthermore, studies describing structural aspects of these proteins are scarce. Thus, the objective of the present study was to investigate the structural properties of the Haloferax volcanii S-layer protein, use them for production of biomimetic S-layer supported lipid platforms and heterologous expression of S-layer fusion proteins in E. coli. The S-layer proteins were purified directly from H. volcanii cells and their structural properties were evaluated through dynamic light scattering, circular dichroism and fluorescence spectroscopy. Transmission electron microscopy was used for analyses of the protein’s self-assembly properties as well as H. volcanii cell envelope preparations. Lipid monolayers using DPPE, DPPC and DPhPE were produced through Langmuir-Blodgett. The protein’s secondary structure is affected by pH values in the medium, with higher beta sheet detection in more alkaline values. This factor also affects the protein’s tertiary structure, with higher tryptophan exposure to the environment in higher pH. Dynamic light scattering essays revealed oligomer formation in all pH values evaluated, indicating that the protein’s self-assembly process occurs in these conditions. However, micrograph images showed that these oligomers do not resemble the lattice found on the H. volcanii cell surface, and correct lattice formation was only achieved in higher salt concentrations. The concentrations of sodium, magnesium and calcium ions in the environment affect the protein’s secondary and tertiary structures, which influences the protein’s functional properties. On the Langmuir-Blodgett essays, an increase of surface pressure was detected on all lipid monolayers tested, indicating a potential use of the H. volcanii S-layer proteins in artificial lipid platform production. It was also possible to isolate the protein’s encoding gene and heterologous protein expression was successful in E. coli cells.