Avaliação de duas ORFs pertencentes ao cluster de produção de lovastatina em Aspergillus terreus

• Main Author: Rodrigues, Kelly Assis
• Other Authors: Parachin, Nádia Skorupa
• Language: Portuguese
• Published: 2018
• Subjects: Fungos; Hipercolesterolemia; Lovastatina
• Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/32309

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. === Submitted by Raquel Viana ([e-mail]) on 2018-07-16T19:55:24Z No. of bitstreams: 1 2018_KellyAssisRodrigues.pdf: 1974995 bytes, checksum: 94214c05a1fc072d588e7467b369e9ab (MD5) === Approved for entry into archive by Raquel Viana ([e-mail]) on 2018-07-20T21:10:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_KellyAssisRodrigues.pdf: 1974995 bytes, checksum: 94214c05a1fc072d588e7467b369e9ab (MD5) === Made available in DSpace on 2018-07-20T21:10:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_KellyAssisRodrigues.pdf: 1974995 bytes, checksum: 94214c05a1fc072d588e7467b369e9ab (MD5) Previous issue date: 2018-07-16 === Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). === Aspergillus terreus é um fungo filamentoso de importância biotecnológica por ser produtor de enzimas de interesse comercial, além de metabolitos secundários como a lovastatina. Esta é utilizada no tratamento de pessoas com hipercolesterolemia uma vez que é um inibidor competitivo da HMG-CoA redutase, enzima responsável pela conversão de HMG-CoA em Mevalonato, diminuindo assim a síntese de colesterol endógeno. Os 18 genes codificadores de enzimas envolvidas na via biosintética de lovastatina estão organizados em um agrupamento gênico de 65 kb no genoma de A. terreus. Dentre esses, genes essenciais já foram identificados, como os genes lovB e lovF, que codificam as principais enzimas da via. Apesar de vários estudos a respeito da via biosintética de lovastatina, ainda existem 10 genes do cluster com a função desconhecida ou predita. Dentre eles a ORF8 (open Reading frame), anotada como um possível gene de resistência. Análises de similaridades mostraram que esta ORF codifica para uma HMG-CoA redutase, sendo que o fungo ainda tem outras duas regiões fora do cluster de lovastatina que também codificam HMG-CoA redutase. Alinhando as três sequências, a ORF8 e as duas enzimas de fora do cluster, foi possível observar que a HMG-CoA redutase, codificada pela ORF8, possui duas mutações no sítio de ligação. Assim, para a caracterização da HMG-CoA redutase, que a ORF8 codifica, foi clonada a sequência no plasmídeo pET28a para expressa-la em Escherichia coli. O plasmídeo foi inserido em quatro linhagens de E. coli, nas quais não foi observada a expressão da proteína. Assim foram desenhados oligonucleotídeos iniciadores para que a ORF8 fosse clonada no vetor p416TEF, que possui a marca de seleção auxotrófica URA3 para inserção na levedura Saccharomyces cerevisiae. No entanto foi possível detectar a produção da enzima em S. cerevisiae pois a ligação do vetor e o inserto não foi alcançada. Outra ORF com função predita é a ORF10, anotada como um possível transportador de lovastatina. Dessa forma, para confirmar sua função biológica, foi realizada sua deleção na cepa ATCC20542, usada como referência para produção de lovastatina. A montagem do cassete de deleção foi realizada em 2 partes, sendo a primeira a amplificação por PCR do cassete de resistência a Higromicina B e dos fragmentos que flanqueiam o gene; e a segunda a fusão dos três fragmentos utilizando a técnica de PCR. O cassete de deleção foi utilizado na transformação da cepa de A. terreus ATCC20542, usada como referência para produção de lovastatina. Após os experimentos de transformação, os 17 clones obtidos foram cultivados em meio definido para quantificação da produção de lovastatina, tanto em sobrenadante quanto em micélio. Dentre os clones avaliados, em 4 clones não foi possível detectar lovastatina no sobrenadante, já em micélio foi observada uma redução de aproximadamente 60% de lovastatina produzida. Estes 4 clones tiveram então seu DNA genômico extraído e usado como molde em reações de PCR. Dessa foram foi possível confirmar que a ORF10 estava realmente deletada nas cepas cuja produção de lovastatina no sobrenadante foi eliminada evidenciando experimentalmente que essa ORF está, de fato, relacionada ao transporte de lovastatina. === Aspergillus terreus is a filamentous fungus of biotechnological importance because it produces enzymes of commercial interest, as well as secondary metabolites like lovastatin. It is used without treatment of people with hypercholesterolemia since it is a competitive inhibitor of HMG-CoA reductase, enzyme responsible for the conversion of HMG-CoA to Mevalonate, thus decreasing as endogenous cholesterol synthesis. The 18 genes encoding enveloping enzymes in the lovastatin biosynthetic pathway are organized into a 65 kb gene cluster in the A. terreus genome. Among these, essential genes have already been identified, as the genes are lovB and lovF, which code as major pathway enzymes. In spite of several genes of the cluster with an unknown or predicted function. There are still 10 cluster genes with an unknown or predicted function. Among them, an ORF8 (open reading frame), annotated as a possible resistance gene. Analyzes of analyzes similar to this ORF code for an HMG-CoA reductase, and the fungus still has other regions for the lovastatin cluster that also encode HMG-CoA reductase. Aligning as three sequences, one ORF8 and two enzymes from outside the cluster, and just like an HFG-CoA reductase encoded by ORF8 does not have two bonds. Thus, for a characterization of HMG-CoA reductase, which is an ORF8 coding, the sequence in plasmid pET28a was cloned to express in Escherichia coli. The plasmid was inserted into four E. coli lines, in which no expression of the protein was observed. Thus, oligonucleotide primers were designed so that the ORF8 was cloned into the p416TEF vector, which has an auxotrophic selection tag URA3 for insertion into the yeast Saccharomyces cerevisiae. However, the possibility of detecting the production of the enzyme in S. cerevisiae at a link of the vector and the insertion was not achieved. Another ORF with predicted function is an ORF10, annotated as a possible lovastatin transporter. Thus, to confirm its biological function, its deletion was carried out in strain ATCC20542, used as reference for lovastatin production. One assembly of a deletion was performed in 2 parts, a first PCR amplification of hygromycin B resistance cassette and fragments flanking the gene; and the second a fusion of the three fragments using a PCR technique. The deletion cassette was used in the transformation of A. terreus strain ATCC20542, used as a reference for lovastatin production. After the transformation experiments, the 17 clones obtained were cultured in defined medium for quantification of lovastatin production, both in supernatant and in mycelium. Among the clones, in 4 clones, it was not possible to detect lovastatin in the supernatant, while in the mycelium a reduction of approximately 60% of lovastatin produced was observed. These 4 clones had their genomic DNA extracted and used as template in PCR reactions. From this it was possible to confirm that ORF10 was indeed deleted in strains whose production of lovastatin in the supernatant was eliminated experimentally evidencing that this ORF is, in fact, related to the transport of lovastatin.