Desenvolvimento e validação de kit diagnóstico NAT utilizando PCR em tempo real para detecção de parasitas protozoários

• Main Author: Amorim, Thainá de Melo Lessa
• Other Authors: Lima, Beatriz Dolabela de
• Language: Portuguese
• Published: 2018
• Subjects: Sangue - doação; Doenças de Chagas; Leishmaniose; Malária; Toxoplasmose
• Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/31896

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2018. === Submitted by Raquel Almeida ([e-mail]) on 2018-05-15T20:04:42Z No. of bitstreams: 1 2018_ThainádeMeloLessaAmorim.pdf: 2404105 bytes, checksum: 9fcf175fa9624298e799cbd236095c91 (MD5) === Approved for entry into archive by Raquel Viana ([e-mail]) on 2018-05-17T17:45:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_ThainádeMeloLessaAmorim.pdf: 2404105 bytes, checksum: 9fcf175fa9624298e799cbd236095c91 (MD5) === Made available in DSpace on 2018-05-17T17:45:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_ThainádeMeloLessaAmorim.pdf: 2404105 bytes, checksum: 9fcf175fa9624298e799cbd236095c91 (MD5) Previous issue date: 2018-05-16 === O teste de amplificação de ácidos nucleicos (NAT) é baseado na PCR em tempo real (qPCR), sendo atualmente utilizado na triagem de doadores em bancos de sangue, para detectar a presença do material genético dos vírus HIV, HBV e HCV em bolsas destinadas à doação. Este teste é mais sensível do que as técnicas sorológicas, por ser capaz de detectar a infecção na fase aguda antes do aparecimento de anticorpos, reduzindo o período de janela imunológica. Até o momento, nenhum teste NAT foi desenvolvido para a pesquisa de patógenos protozoários e a transmissão de doenças parasitárias via transfusão sanguínea e transplante de órgãos aumentou nos últimos anos. Neste trabalho, desenvolvemos um teste de diagnóstico NAT utilizando qPCR Sybr Green e TaqMan para a pesquisa do DNA de protozoários de alta relevância clínica, transmissíveis via transfusão sanguínea e endêmicos no Brasil, como o Trypanosoma cruzi, causador da doença de Chagas, Leishmania spp., causadoras das leishmanioses, Toxoplasma gondii, causador da Toxoplasmose, e Plasmodium spp., causadores da malária. Para tanto, foram utilizados pares de primers específicos para amplificação de genes conservados de cada um destes patógenos. Com relação aos testes de eficiência dos pares de primers utilizados, não houve perda de linearidade, pois os declives se mantiveram próximos de 100%. A sensibilidade para detecção de T. cruzi, Leishmania sp. e Plasmodium sp. foi semelhante na qPCR Sybr Green e TaqMan, para T. gondii, a qPCR TaqMan foi mais sensível, detectando um limite de 0,005 parasitas/µL. Constatamos que com relação à linearidade e sensibilidade ambas as metodologias são similares e com relação à especificidade, a TaqMan qPCR que utiliza sondas fluorogênicas gene-específicas marcadas com fluoróforos diferentes, apresentouse superior ao Sybr Green qPCR, possibilitando a definição do tipo de protozoário presente na amostra a ser analisada. Deste modo, propomos o sistema de qPCR Sybr Green utilizando primers com alvo no rRNA 28S de Trypanosomatidae para a amplificação dos genes de T. cruzi e Leishmania sp. e com alvo no rRNA 18S para os genes de Plasmodium sp. e T. gondii. para ser utilizado nos testes de triagem. Em uma segunda etapa, o sistema qPCR TaqMan deve ser então utilizado nos testes confirmatórios. Deste modo, o estabelecimento deste teste diagnóstico na rotina de bancos de sangue contribuirá fortemente para o aumento da segurança transfusional. === The nucleic acid amplification test (NAT) is based on real-time PCR (qPCR) and is currently used in blood donor screening to detect the presence of the genetic material of HIV, HBV and HCV viruses in donated pockets. This test is more sensitive than serologic techniques, because it is able to detect acute infection before the appearance of antibodies, reducing the period of immunological window. To date, no NAT test has been developed for protozoan pathogen research, and transmission of parasitic diseases via blood transfusion and organ transplantation has increased in recent years. In this work, we developed a NAT diagnostic test using qPCR Sybr Green and TaqMan to investigate the DNA of protozoa of high clinical relevance, transmissible through blood transfusion and endemic in Brazil, such as Trypanosoma cruzi, which causes Chagas disease, Leishmania spp. , causing the leishmaniasis, Toxoplasma gondii, causative of toxoplasmosis, and Plasmodium spp., causing malaria. For this, specific pairs of primers were used for the amplification of conserved genes of each of these pathogens. Regarding the efficiency tests of the pairs of primers used, there was no loss of linearity, since the slopes remained close to 100%. The sensitivity for detection of T. cruzi, Leishmania sp. and Plasmodium sp. was similar in qPCR Sybr Green and TaqMan, for T. gondii, qPCR TaqMan was more sensitive, detecting a limit of 0.005 parasites / μL. We found that with regard to linearity and sensitivity both methodologies are similar and with respect to specificity, TaqMan qPCR that uses gene-specific fluorogenic probes labeled with different fluorophores, was superior to Sybr Green qPCR, allowing the definition of protozoan type present in the sample to be analyzed. Thus, we propose the Sybr Green qPCR system using target primers in the Trypanosomatidae 28S rRNA for the amplification of the T. cruzi and Leishmania sp. and targeted at the 18S rRNA for the Plasmodium sp genes and T. gondii to be used in the screening tests. In a second step, the TaqMan qPCR system should be used in the confirmatory tests. In this way, the establishment of this diagnostic test in routine blood banks will contribute greatly to the increase of transfusion safety.