Revelando o potencial de Clonostachys byssicola em produzir enzimas holocelulolíticas

• Main Author: Gomes, Helder Andrey Rocha
• Other Authors: Ricart, Carlos André Ornelas
• Language: Inglês; Portuguese
• Published: 2018
• Subjects: Fungos - aplicações industriais; Enzimas; Resíduos vegetais
• Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/31228

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. === Submitted by Raquel Almeida ([e-mail]) on 2017-12-18T17:05:33Z No. of bitstreams: 1 2017_HelderAndreyRochaGomes.pdf: 9717796 bytes, checksum: 867d9ecbaf434e11f556f56ee7be8f83 (MD5) === Approved for entry into archive by Raquel Viana ([e-mail]) on 2018-02-15T16:54:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_HelderAndreyRochaGomes.pdf: 9717796 bytes, checksum: 867d9ecbaf434e11f556f56ee7be8f83 (MD5) === Made available in DSpace on 2018-02-15T16:54:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_HelderAndreyRochaGomes.pdf: 9717796 bytes, checksum: 867d9ecbaf434e11f556f56ee7be8f83 (MD5) Previous issue date: 2018-02-15 === Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). === Os fungos filamentosos saprofíticos representam fontes promissoras de enzimas holocelulolíticas, e o cultivo desses organismos em fontes de carbono indutoras baratas, como resíduos agrícolas, permitiria a obtenção de coquetéis enzimáticos com custos reduzidos. Neste trabalho, o potencial de um isolado de Clonostachys byssicola para a produção de enzimas holocelulolíticas é descrito. A avaliação do secretoma produzido pelo fungo em cultivo submerso com diversas fontes de carbono lignicelulósicas através de eletroforese em BN-PAGE revelou a presença de bandas de alta massa molecular, correspondentes à complexos proteicos putativos. A partir da identificação desses complexos por LC-MS/MS, verificou-se que os complexos abrigam diversas enzimas envolvidas na degradação de holocelulose, como celulases, mananases, xilanases e pectinases. Os complexos também são cataliticamente ativos, uma vez que foi possível identificar atividade enzimática in gel. Em outra etapa do trabalho, o secretoma do fungo obtido em fontes de carbono comerciais (Avicel, carboximetilcelulose-CMC e xilana de aveia) e agroindustriais (sabugo de milho, casca do grão de soja, engaço de bananeira e bagaço de cana-de-açúcar) foi caracterizado por LC-MS/MS. A maior diversidade de proteínas foi identificada no secretoma obtido em Avicel, seguido pelo secretoma obtido em sabugo de milho. Foram identificadas várias enzimas relacionadas à degradação da lignocelulose, o que evidencia que o fungo é capaz de produzir sistemas enzimáticos completos específicos para cada uma das principais frações da holocelulose: celulose, hemiceluloses e pectina. Os secretomas obtidos em resíduos agroindustriais foram empregados para sacarificar sabugo de milho e bagaço de cana-de-açúcar parcialmente delignificados. Os extratos brutos produziram mais açúcares a partir da hidrólise do sabugo, revelando uma maior digestibilidade deste substrato quando comparado ao bagaço, o que pode decorrer do menor teor de lignina observado após o tratamento do sabugo de milho. Os secretomas permitiram a solubilização de grande parte da xilana presente no sabugo de milho, com a liberação de xilobiose como principal produto de hidrólise. O isolado de C. byssicola foi ainda avaliado quanto à capacidade de produção de enzimas pectinolíticas quando cultivado em meio contendo casca de laranja como única fonte de carbono. O fungo foi capaz de secretar pectinases e pectato liases. A caracterização do secretoma feita por LCMS/MS revelou uma grande diversidade de enzimas atuantes na cadeia principal e sobre substituintes laterais. Uma fração parcialmente purificada foi caracterizada quanto ao efeito da temperatura e pH, e a atividade de pectinase foi máxima a 50ºC, e na faixa de pH entre 4,5 e 6,0. Estas características sugerem a aplicação da enzima para o tratamento de sucos de frutas com baixa acidez. Uma das enzimas parcialmente purificada foi identificada por LC-MS/MS, e a partir desta identificação, o transcrito correspondente foi clonado com sucesso em Escherichia coli, e a etapa de expressão em Pichia pastoris se encontra em andamento. Todos os resultados deste trabalho revelam C. byssicola como uma nova fonte de enzimas holocelulolíticas, que ainda precisa ser explorada. === Saprophytic filamentous fungi represent promising sources of holocellulolytic enzymes, and the cultivation of these organisms in inexpensive inducing carbon sources, such as agricultural residues, would allow the production of enzymatic cocktails at reduced costs. In this work, the potential of a Clonostachys byssicola strain for the production of holocellulolytic enzymes is described. The evaluation of the secretome produced by the fungus in submerged culture with several lignicellulosic carbon sources through BN-PAGE electrophoresis revealed the presence of bands of high molecular mass, corresponding to the putative protein complexes. From the identification of these bands by LC-MS / MS, the complexes were found to harbor several enzymes involved in the degradation of holocellulose, such as cellulases, mannanases, xylanases and pectinases. The complexes are also catalytically active, since it was possible to identify in gel enzymatic activity. In another stepe of the work, the secretome of the fungus obtained in commercial (Avicel, carboxymethylcellulose-CMC and oat spealt xylan) and agroindustrial (corn cob, soybean hull, banana and sugarcane bagasse, sugar) carbon sources was characterized by LC-MS / MS. The greatest diversity of proteins was identified in the secretome obtained from Avicel and corn cob, respectively. Several enzymes related to the degradation of lignocellulose were identified, which shows that the fungus is able to produce complete enzymatic systems specific to each of the main holocellulose fractions: cellulose, hemicelluloses and pectin. The secretomes obtained from agroindustrial residues were used to saccharify partially-delignified corn cob and sugarcane bagasse. The crude extracts released more sugars from the hydrolysis of corn cob, revealing a higher digestibility of this substrate when compared to the bagasse, which may be due to the lower lignin content observed after corn cob treatment. The secretomes allowed the solubilization of a large part of the xylan present in the corn cob, with the release of xylobiose as the main hydrolysis product. C. byssicola strain was also evaluated for the production of pectinolytic enzymes when grown in medium containing orange peel as the sole carbon source. The fungus was able to secrete pectinases and pectate lyases. The characterization of the secretome by LC-MS / MS revealed a large diversity of enzymes acting on the main chain and side substituents. A partially purified fraction was characterized regarding the effect of temperature and pH, and the pectinase activity was maximal at 50 ° C and in the pH range between 4.5 and 6.0. These characteristics suggest the application of the enzyme for the treatment of fruit juices with low acidity. One of the partially purified enzymes was identified by LCMS / MS, and from this identification, the corresponding transcript was successfully cloned in Escherichia coli, and the expression step in Pichia pastoris is underway. All the results of this work reveal C. byssicola as a new source of holocellulolytic enzymes, which still needs to be explored.