| Summary: | Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. === Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-08-03T19:51:12Z
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Previous issue date: 2017-09-15 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES === O aumento do número de cópias do gene heterólogo é uma das abordagens empregadas no melhoramento genético de Komagataella phaffii como sistema de expressão. O uso de marcas auxotróficas defectivas é uma estratégia para a obtenção de integrantes multicópia. Para garantir estabilidade mitótica, os cassetes de expressão são integrados no genoma por recombinação homóloga, portanto é necessário haver no vetor sequências genômicas que propiciem esses eventos de integração. O foco deste trabalho foi identificar sítios repetitivos no genoma de K. phaffii nunca antes testados como alvos de integração, em combinação com o uso da marca defectiva leu2-d, para aumentar a expressão heteróloga. Como alvos para integração múltipla foram avaliados os seguintes loci: rDNA 5S, região NTS do rDNA e regiões repetidas dos cromossomos 2 e 3. Um vetor contendo a marca leu2-d e o gene repórter EGFP (Enhanced Green FluorescentProtein) foi construído e foi usado como plataforma para clonar as diversas sequências repetidas. Todas as construções foram utilizadas para transformar K. phaffii M12 (leu2). A determinação do número de cópias integradas do cassete de expressão confirmou a obtenção de clones multicópia com todas as construções. Até 78 cópias do cassete contendo a sequência repetitiva do cromossomo 2 foram integradas. Todos os clones multicópiaapresentaram uma maior produção intracelular de GFP em comparação a um clone contendo uma única cópia do gene, chegando a se obter um aumento de 197 vezes com o clone contendo 78 cópias integradas do cassete. Para validar a estratégia apresentada neste estudo, foi testada a produção extracelular da proteína repórter α-amilase. Clones multicópia foram obtidos com as diferentes construções e até 43 cópias do cassete contendo a sequência repetitiva do cromossomo 2 foram integradas. A atividade amilolítica no sobrenadante confirmou a produção de amilase, que foi maior para os clones multicópia em comparação a um clone contendo uma cópia do gene, chegando a se obter um aumento de 4,6 vezes com o clone contendo 43 cópias integradas do cassete. A produção das duas proteínas avaliadas, demonstrou a possibilidade de obter clones multicópia que produzem uma maior quantidade da proteína recombinante. Contudo, foi observada perda de algumas cópias do cassete quando os clones transformantes foram crescidos em meio complexo, indicando baixa estabilidade genética na falta de pressão seletiva. Além disso, dependendo do local de integração, um alto número de cópias mostrou ter um efeito negativo no crescimento da levedura, porém, em nenhum dos casos a produção da proteína heteróloga diminuiu. === Increasing heterologous gene copy number is one of most commonly used strategies to improve Komagataellaphaffii as an expression system. The use of defective auxotrophic markers is an approach to obtain multicopy integrants. Expression cassettes must be integrated into the K. phaffii genome by homologous recombination to ensure mitotic stability. Therefore, it is necessary that the vector carries genomic sequences that will promote integration events. The aim of this work was to identify different sites for the integration of vectors carrying the auxotrophic defective marker leu2-d into the genome in order to increase the expression levels of heterologous genes in K. phaffii. The targets for integration studied were the following loci: 5S rDNA, NTS rDNA and repetitive regions of chromosomes 2 and 3. A vector carrying defective marker leu2-d and the EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein) reporter gene was constructed. This vector was used as platform to test repetitive sequences as targets for DNA integration. All constructions were used to transform K. phaffii M12 (leu2). Copy number determination confirmed the generation of multicopy clones with all the constructions. Up to 78 copies of the cassette containing the sequence of chromosome 2 were integrated. All multicopy clones showed more intracellular GFP production compared with a single-copy clone. A 197- fold increase of protein production was observed with the clone containing 78 copies of the cassette. To validate the strategy presented in this study, the expression of the reporter protein α- amylase was evaluated. Multicopy clones were obtained with the diverse constructions. Up to 43 copies of the cassette containing the sequence of chromosome 2 were integrated. Amylolytic activity in culture supernatants confirmed amylase production, which was higher for multicopy clones in comparison with a single-copy clone. A 4.6-fold increase of protein production was observed with the clone containing 43 copies of the cassette. Production of the two proteins tested showed the possibility to obtain multicopy clones which produce a larger quantity of the recombinant protein. Nevertheless, loss of some copies of the expression cassette was observed when transformants were grown in complex medium. This indicated low genetic stability in the absence of selective pressure. Moreover, depending of the integration locus higher copy number showed a negative effect in yeast growth. However, heterologous protein production was not decreased.
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