| Summary: | Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. === Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-01-30T15:01:10Z
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2016_DanielAmaroSousa.pdf: 4401658 bytes, checksum: b3a650245da825ef86db8e24d979983a (MD5) === Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-13T18:58:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1
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2016_DanielAmaroSousa.pdf: 4401658 bytes, checksum: b3a650245da825ef86db8e24d979983a (MD5) === Um dos mais importantes aspectos relacionados aos patógenos infecciosos pode ser relacionado à sua excepcional adaptabilidade para o desenvolvimento de resistência, o que leva a um desafio de descoberta de novas drogas antimicrobianas, com novos mecanismos de ação. Entre estes, os peptídeos antimicrobianos (PAMs) se apresentam como promissoras moléculas anti-infectivas. Buscando superar os altos custos associados com o isoladamente a partir de fontes naturais ou da síntese química de PAMs, propõem-se no presente trabalho a expressão do Pa-MAP 2, um PAM rico em alaninas. Para isso, este peptídeo foi fusionado a um marcador ELP-inteína, onde o ELP foi usado para promover a auto-agregação, possibilitando um isolamento rápido e de baixo custo. A inteína foi usada para permitir a liberação controlada do peptídeo. Para isso, o vetor pET 21a foi usado para produzir o Pa-MAP 2 fusionado a região N-terminal da inteína modificada Mxe GyrA, seguido por um ELP de 60 repetições. Após purificação, o Pa-MAP 2 demonstrou MIC contra E. coli ATCC 8739 de 25 μM. A análise do cultivo em biorreator demonstrou que o Pa-MAP 2 pode ser produzido tanto em meio rico quanto em meio definido, com rendimento 50 vezes superior que o reportado para outros peptídeos produzidos pelo sistema ELP-inteína, e em rendimentos comparáveis a sistemas de expressão com clivagem química ou proteases. Desta forma, a metodologia do presente trabalho contribui para aplicação biotecnológica dos PAMs. Os resultados aqui apresentados demonstram uma comparação de diferentes condições de cultivo, para obter alto rendimento do Pa-MAP 2, usando o sistema ELP-inteína, contribuindo para incluir os PAMs como futuras alternativas aos antimicrobianos convencionais. === One of the most important aspects related to infectious pathogens may be correlated to an exceptional adaptability in developing resistance, which leads to a challenge in the discovery of antimicrobial drugs with novel mechanisms of action. Among them, antimicrobial peptides (AMPs) stand out as promising anti-infective molecules. In order to overcome the high costs associated with isolation from natural sources or chemical synthesis of AMPs we propose the expression of Pa-MAP 2, a polyalanine AMP. Pa-MAP 2 was fused to an ELP-intein tag where the ELP was used to promote aggregation and fast and cost-effective isolation after expression, and the intein was used to stimulate a controlled AMP release. For these, the vector pET21a was used to produce Pa-MAP 2 fused to the N-termini region of a modified Mxe GyrA intein followed by 60 repetitions of ELP. Purified Pa-MAP 2 showed a MIC of 25 μM against E. coli ATCC 8739. Batch fermentation demonstrated that Pa-MAP 2 can be produced in both rich and defined media at yields 50-fold higher than reported for other AMPs produced by the ELP-intein system, and in comparable yields to expression systems with protease or chemical cleavage. Therefore, the methodology applied here contributes to the biotechnological application of AMPs. Our results show a comparison of different fermentation conditions to obtain high yields of Pa-MAP 2 using the ELP-intein system, contributing to including these molecules as future alternatives to conventional antibiotics in the pharmaceutical field.
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