Expressão de proteína parasporina 2 (PS2) de bacillus thuringiensis em células de inseto e análise de sua toxicidade para células tumorais e de insetos

• Main Author: Lamar, Deborah da Costa
• Other Authors: Ribeiro, Bergmann Morais
• Language: Portuguese
• Published: 2016
• Subjects: Bacillus thuringiensis; Endotoxina; Baculovírus; Células cancerosas
• Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/21428

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. === Submitted by Fernanda Percia França ([e-mail]) on 2016-09-01T14:41:43Z No. of bitstreams: 1 2016_DeborahdaCostaLamar.pdf: 2872393 bytes, checksum: 9d419a56e6761d5e59959dc81459806d (MD5) === Approved for entry into archive by Raquel Viana([e-mail]) on 2016-09-09T12:10:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DeborahdaCostaLamar.pdf: 2872393 bytes, checksum: 9d419a56e6761d5e59959dc81459806d (MD5) === Made available in DSpace on 2016-09-09T12:10:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DeborahdaCostaLamar.pdf: 2872393 bytes, checksum: 9d419a56e6761d5e59959dc81459806d (MD5) === Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram positiva, produtora de cristais protéicos ou δ-endotoxinas (toxinas Cry e Cyt) durante a fase de esporulação. As toxinas. Cry apresentam atividade inseticida específica, e as toxinas Cyt apresentam atividade citolítica inespecífica. Algumas proteínas produzidas por B. thuringiensis durante a fase de esporulação que não apresentam caráter inseticida, mas apresentam-se tóxica para células tumorais foram descritas. Essas proteínas receberam o nome de Parasporinas (PS), devido à capacidade de produzir cristais paraesporais e até o momento são classificadas em seis tipos (PS1-PS6). Baculovírus são vírus de insetos usados no controle biológico de pragas da agricultura, porém também têm sido muito utilizados como vetores de expressão de proteínas heterólogas em células de inseto. No presente trabalho, o gene ps2 foi montado, por meio de PCR, através de fragmentos sintetizados a partir de uma sequência lotada no banco de dados, e o produto de PCR foi clonado em um vetor de transferência para construção de um baculovírus recombinante. Após obtenção do vírus recombinante, observou-se que células SF9 quando infectadas com vAcPS2, morriam em um tempo curto de infecção, quando comparado com células infectadas com o vírus selvagem. Após purificação, solubilização e ativação da toxina PS2 recombinante, ensaios de viabilidade celular foram feitos com linhagens de células tumorais, câncer mamário (MCF-7) e câncer mamário metastático (MDA-MB-231), células não tumorais humanas (fibroblastos) e células de inseto (Sf9), confirmando a atividade tóxica de PS2 apenas para as células tumorais. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT === Bacillus thunringiensis is a Gram positive bacterium that produces crystal forming proteins called δ-endotoxins (Cry and Cyt toxins), during sporulation phase. Cry toxins show specific insecticidal activity, and Cyt toxins shows non-specific cytolitic activity. Some proteins of B. thuringiensis produced during sporulation have not shown insecticidal activity, but a specific toxic activity to some cancer cells. These proteins were called Parasporins (PS) due to their ability to form paraporal crystals and they are divided in six groups (PS1-PS6). Baculoviruses are insect viruses that have been widely used as biological control of agricultural pests, but also as expression vectors of heterologous proteins in insect cells. In this work, the gene ps2, constructed by PCR, trough fragments synthetized using a gene sequence from a database and cloned in a transfer vector for recombinant virus construction After recombinant virus construction we observed that SF9 cells died faster than cells infected with the wild-type virus. After purification, solubilization and activation of the heterologous protein, cell viability assays was performed with cancer cell lines, breast cancer (MCF-7), metastatic brest cancer (MDA-MB-231), non-tumor human cells (fibroblasts) and insect cells (Sf9) confirming PS2 toxic activity only to cancer cells.