| Summary: | Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação Nanociência e Nanobiotecnologia, 2016. === Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-05-25T13:46:24Z
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2016_AliciaSimalieOmbredane.pdf: 2064852 bytes, checksum: b44036cc1dea0669306297b2c133343e (MD5) === O câncer de pele não melanoma (CPNM) é o tipo de tumor de maior incidência no Brasil, e o subtipo maligno denominado de carcinoma epidermoide representa 70% das mortes por CPNM. Os tratamentos convencionais apresentam grande chance de cura, entretanto, são geralmente associados a vários efeitos colaterais adversos localizados e/ou sistêmicos. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas é de grande interesse. O uso de compostos naturais e de nanopartículas de prata (AgNPs) demonstram uma grande relevância para o tratamento de vários tipos de câncer. Adicionalmente, a síntese verde de AgNPs consiste em utilizar organismos biológicos e/ou biomoléculas isoladas como agentes redutores e estabilizantes. Portanto, o método de síntese se torna mais eco-amigável, de menor custo e biocompatível. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho é de sintetizar AgNPs utilizando extrato aquoso (EA) do tubérculo de açafrão (Curcuma longa) e nitrato de prata (AgNO3), associá-las com polímeros de quitosana, caracterizá-las, avaliar a citotoxicidade em células tumorais de CPNM (A431) e não tumorais (queratinócitos - HaCAT) e investigar seus possíveis mecanismos de ação em linhagem de CPNM (A431), in vitro. O rendimento da síntese de AgNPs foi dependente da variação de temperatura de armazenamento da C. longa, do método de extração, da temperatura de síntese e da concentração de EA e de AgNO3. Após a otimização da síntese (C. longa armazenada a temperatura ambiente, extração por fervura, síntese a 75°C por 24 horas com 2 mg/mL de EA e 1 mM de AgNO3) a quitosana foi utilizada para recobrir as AgNPs devido às suas propriedades de biocompatibilidade, biodegradabilidade e bioadesividade. As AgNPs obtidas apresentaram uma homogeneidade e estabilidade coloidal moderadas (PdI de 0,319 ± 0,043 e potencial Zeta de -24,8 ± 2,2 mV) com diâmetro hidrodinâmico (DH) de 210,3 ± 57,1 nm. Em paralelo, as AgNPs recobertas por quitosana (CH-AgNPs) apresentaram DH de 328,0 ± 61,6 nm, moderada homogeneidade (PdI de 0,372 ± 0,059) e estabilidade coloidal (potencial Zeta de +53,9 ± 3,1 mV). A forma das nanopartículas foi avaliada por técnicas de microscopia. As amostras demonstraram ser estáveis por 30 dias a 4°C. Além disso, ambas demonstraram atividade citotóxica dose-dependente em células A431 e HaCAT. A investigação dos possíveis mecanismos de ação das AgNPs expostas às células A431 por 24 horas a 50μM demonstrou a indução de lesão de membrana plasmática (50%), diminuição da proliferação celular (50%), aumento da taxa de fragmentação de DNA (40%) e do potencial de membrana mitocondrial. Além disso, as CH-AgNPs bloquearam as células em fase G1 do ciclo celular e apresentaram maior marcação por Anexina-V, sugerindo morte celular por apoptose. Em suma, pode-se concluir que a síntese verde demonstrou ser uma boa alternativa para a obtenção de AgNPs com grande potencial citotóxico. A associação com a quitosana pode representar um potencial promissor para o tratamento de CPMN. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT === Nonmelanoma skin cancers (NMSC) represents the most incident tumor in Brazil, and the malignant subtype squamous cell carcinoma accounts for 70% of deaths from NMSC. Conventional treatments have great chance of cure, however, they are usually associated with several localized and/or systemic adverse side effects. Therefore, the development of new therapeutic strategies is of great interest. The use of natural compounds and silver nanoparticles (AgNPs) showed a great importance for the treatment of various cancers. Additionally, the green synthesis of AgNPs consists of using biological organisms and/or biomolecules isolated as reducing agents and stabilizers. Therefore, this method of synthesis becomes more eco-friendly, less costly and biocompatible. Given the above, the objective of this study is to synthesize AgNPs using aqueous extract (EA) of turmeric tuber (Curcuma longa) and silver nitrate (AgNO3), associate them with chitosan polymers, characterize them, analyze the cytotoxicity NMSC tumor (A431) and non-tumor cells (keratinocytes - HaCaT) and investigate the possible mechanisms of action in NMSC cells line (A431) in vitro. The yield of synthesis was dependent on the variation of the storage temperature of C. longa, the method of extraction, the temperature of synthesis and the concentration of EA and AgNO3. After optimization of the synthesis parameters (C. longa stored at room temperature, extraction by boiling, and synthesis at 75°C for 24 hours with 2 mg/ml EA and 1 mM AgNO3) chitosan was used to coat AgNPs due to its properties of biocompatibility, biodegradability and bioadhesiveness. The obtained AgNPs showed a moderate homogeneity and colloidal stability (0.319 ± 0.043 PDI and Zeta potential of - 24.8 ± 2.2 mV) with hydrodynamic diameter (HD) of 210.3 ± 57.1 nm. In parallel, covered with chitosan (CH-AgNPs) exhibited HD of 328.0 ± 61.6 nm, moderate homogeneity (PDI 0.372 ± 0.059), and colloidal stability (Zeta potential of +53.9 ± 3.1 mV). The shape of the nanoparticles was analyzed by microscopy techniques. The samples proved to be stable for 30 days at 4°C. In addition, both showed dosedependent cytotoxic activity in HaCaT and A431 cells. The investigation of possible mechanisms of action of AgNPs exposed to A431 cells for 24 hours at 50 μM demonstrated the induction of plasma membrane injury (50%), reduction of cell proliferation (50%), increased of DNA fragmentation rate (40%) and mitochondrial membrane potential and induction of cell death by apoptosis. Furthermore, CH-AgNPs blocked cells in G1 phase of the cell cycle and presented anexin-V dialing suggesting cell death by apoptosis. In short, it can be concluded that the green synthesis proved to be a good alternative for obtaining AgNPs with high cytotoxic potential. The association with chitosan may represent a promising potential for the treatment of CPMN.
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