Caracterização da atividade citotóxica da peçonha de Bothrops marmoratus e efeitos de uma PLA2-Lys49 isolada sobre células de adenocarcinoma cervical (Hela) : do transcriptoma ao proteoma

• Main Author: Macêdo, Jéssica Kele Arruda
• Other Authors: Castro, Mariana de Souza
• Language: Portuguese
• Published: 2016
• Subjects: Venenos; Câncer; Apoptose; Fosfolipase A2; Proteômica
• Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/19286

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. === Submitted by Guimaraes Jacqueline ([e-mail]) on 2015-11-11T14:31:12Z No. of bitstreams: 1 2015_JessicaKeleArrudaMacedo.pdf: 7042853 bytes, checksum: 2fd7157750744a04a33aedad26b23527 (MD5) === Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva([e-mail]) on 2016-01-25T13:53:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_JessicaKeleArrudaMacedo.pdf: 7042853 bytes, checksum: 2fd7157750744a04a33aedad26b23527 (MD5) === Made available in DSpace on 2016-01-25T13:53:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_JessicaKeleArrudaMacedo.pdf: 7042853 bytes, checksum: 2fd7157750744a04a33aedad26b23527 (MD5) === Introdução: A emergência contra a resistência de células tumorais às drogas quimioterápicas disponíveis no mercado faz com que o desenvolvimento de novos agentes seja de grande importância. As toxinas isoladas de venenos animais, incluindo serpentes, têm disso sujeitos de numerosos estudos devido ao seu potencial biotecnológico e aplicações médicas. Objetivos: Foram investigados os efeitos provocados pelo tratamento de diversas linhagens celulares com a peçonha bruta de B. marmoratus, bem como os efeitos de uma PLA2 cataliticamente inativa isolada (BmPLA2) sobre células HeLa. Métodos: A abordagem experimental para análise da peçonha bruta incluiu principalmente detecção da viabilidade celular e caracterização do tipo de morte celular por citometria de fluxo. Para análise das alterações transcriptômicas provocadas pelo tratamento com BmPLA2 por 2 h, 12 h ou 24 h RNA extraído foi analisado por microarranjo utilizando Affymetrix GeneChip® Human Gene 2.0 ST. As alterações proteômicas também foram analisadas por meio da descomplexação do lisado protéico utilizando SDS-PAGE, seguida por analise por LC / MS / MS.Resultados: A análise dos resultados permitiu a verificação de morte celular apoptótica causada pela peçonha bruta com IC50 de 5 µg/mL para HeLa, 2,5 µg/mL para B16F10 e 2,2 µg/mL para NIH/3T3. Por outro lado, o IC50 determinado para BmPLA2 foi de 8,7 µM. Os dados de transcriptômica e proteômica juntos, demonstraram as mudanças típicas associadas à apoptose bem como associadas a outras vias importantes como MAPK, adesão focal e autofagia, produzindo insights sobre os mecanismos que levam à morte celular. Conclusões: BmPLA2 induz morte de células tumorais via apoptose, mas pode por outro lado ativar mecanismos relacionados à resistência e sobrevida, sendo portanto necessário a confirmação dessas vias, bem como uma análise mais detalhada e a longo prazo para determinação efetiva do seu efeito. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT === Introduction: The emergence against tumor cell resistance to chemotherapy drugs available in the market makes the development of new agents of great importance. The toxins isolated from animals including snake venoms have been subject of numerous studies due to their potential on biotechnological and medical applications. Objectives: The effects caused by treatment of different cell lines with crude venom of B. marmoratus, as well as the effect of a catalytically inactive PLA2 isolated (BmPLA2) were investigated on HeLa cells. Methods: The experimental approach for analysis of crude venom included mainly detection of cell viability and characterization of cell death by flow cytometry. For analysis of transcriptomic changes caused by treatment with BmPLA2 for 2 h, 12 h and 24 h, extracted RNA was analyzed by microarray using Affymetrix GeneChip® Human Gene 2.0 ST. The proteomic alterations were also analyzed by decomplexation of protein lysate using SDS-PAGE followed by analysis by LC / MS / MS. Results: The results allowed the verification of apoptotic cell death caused by crude venom with IC50 of 5µg / ml to HeLa, 2.5 µg / ml for B16F10 and 2.2 µg / ml for NIH / 3T3. On the other hand, the IC50 for BmPLA2 was 8.7 µM. The transcriptomic and proteomic data together, showed typical changes associated with apoptosis and associated with other pathways such as MAPK, focal adhesion and autophagy, yielding insights into the mechanisms that lead to cell death. Conclusions: BmPLA2 induces tumor cell death via apoptosis but can on the other hand, elicit mechanisms related to the resilience and survival. It is still necessary to confirm these pathways, as well as perform some additional detailed analysis and long-term effective to determine their effect.