Caracterização molecular de Johnsongrass mosaic virus em plantas forrageiras dos gêneros brachiaria, panicum e pennisetum

• Main Author: Silva, Karina Nascimento da
• Other Authors: Resende, Renato de Oliveira
• Language: Portuguese
• Published: 2015
• Subjects: Capim-braquiária; Capim-gordura; Plantas forrageiras; Capim-elefante; Pennisetum; Vírus de plantas
• Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/18300; http://dx.doi.org/10.26512/2015.02.D.18300

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2015. === Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva ([e-mail]) on 2015-05-27T15:15:22Z No. of bitstreams: 1 2015_KarinaNascimentodaSilva.pdf: 2112504 bytes, checksum: 31224eb23b38b4cecca57ec16552a5d9 (MD5) === Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline([e-mail]) on 2015-05-28T14:50:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_KarinaNascimentodaSilva.pdf: 2112504 bytes, checksum: 31224eb23b38b4cecca57ec16552a5d9 (MD5) === Made available in DSpace on 2015-05-28T14:50:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_KarinaNascimentodaSilva.pdf: 2112504 bytes, checksum: 31224eb23b38b4cecca57ec16552a5d9 (MD5) === Atualmente o Brasil possui o maior rebanho bovino comercial do mundo, somando 210 milhões de cabeças de gado para a produção de carne, leite e seus derivados. Com isso é o maior exportador de carne do mundo e o 2º maior produtor mundial, representando 16% desse comércio. Considerando a produção de leite, o Brasil ocupa a 3º posição no mercado mundial. Tal produção ocorre em 48% das áreas ocupadas com atividades rurais, que são destinadas as pastagens naturais e cultivadas. As principais plantas forrageiras plantadas no Brasil são dos gêneros Panicum, Brachiaria e Pennisetum, pertencentes à família Poaceae que têm como centro de origem e diversidade o continente africano. Plantas com sintomas de vírus, têm sido frequentemente encontradas, principalmente nos bancos de germoplasma da Embrapa Gado de Corte no estado do Mato Grosso do Sul, e da Embrapa Gado de Leite no estado da Bahia. Devido à falta de conhecimento do agente etiológico, o presente trabalho visou a identificação e caracterização de vírus em plantas forrageiras dos gêneros Panicum, Brachiaria e Pennisetum. Utilizando a plataforma de sequenciamento de alto desempenho Illumina, foi identificado o Johnsongrass mosaic virus. Inicialmente foi realizado um sequenciamento a partir de um acesso de Pennisetum. Posteriormente, foi realizado um segundo sequenciamento usando amostra composta de 5 acessos de Panicum e 5 de Brachiaria. Com esses sequenciamentos foram obtidos dois genomas de JGMV, um com 9828 nt de extensão, excluindo a cauda poli (A) originário do sequenciamento de Panicum e Brachiaria (JGMV-BR), e o outro com 9649 nt de extensão excluindo a poli (A) e a região 5ˊUTR, originário do sequenciamento de Pennisetum (JGMV-Penni). A técnica do 5ˊRACE foi usada para o isolamento da região 5ˊUTR, somente para um vírus JGMV-BR. A 3ˊUTR para cada isolado também foi amplificada e sequenciada. As análises da sequência predita de aminoácidos possibilitaram a dedução dos sítios de clivagem, bem como a identificação das sequências e motivos conservados dentro da sequência de cada proteína. As análises de comparações do genoma de cada vírus revelaram identidade da capa proteica de 77% (nt) do isolado JGMV-BR e 78% (nt) do isolado JGMV-Penni com o JGMV australiano (NC_003606). De acordo com o critério de demarcação de espécie para Potyvirus, em que o limiar para a demarcação de espécie é de 76-77% de identidade nucleotídica, os dois isolados de JGMV são uma estirpe da mesma espécie. As árvores filogenéticas geradas utilizando as sequências nucleotídicas e peptídicas da poliproteína revelaram que os dois isolados brasileiros de JGMV são filogeneticamente relacionados com o JGMV australiano, e ambos são relacionados ao Canna yellow streak virus. Além disso, várias espécies que infectam monocotiledôneas formaram um clado, onde JGMV se insere. A partir da sequência consenso do genoma completo de JGMV-BR, foram sintetizados primers específicos que correspondiam ao gene da capa proteica para a detecção de JGMV. Além disso, para avaliar a diversidade genética de JGMV, a partir dos 11 acessos utilizados no NGS, fragmentos gênicos de CP foram clonados e de 3 a 5 clones foram sequenciados para cada acesso avaliado. A matriz de comparação das sequências nucleotídicas da CP comparados com os isolados australianos e americanos variou de 77 a 82% de identidade nucleotídica. A árvore filogenética utilizando a sequência nucleotídica da CP, indica a presença de ao menos duas linhagens de JGMV, uma circulando nos EUA/Austrália e outra no Brasil. Além disso, é possível observar que alguns isolados de vírus foram encontrados em mais de um acesso e determinados acesso demostraram a presença de mais de um isolado. Assim, como resultado deste trabalho, foi realizado o primeiro relato de JGMV no Brasil. === Currently, Brazil has the largest commercial herd in the world, totaling 210 million head of cattle, for the production of meat, milk and dairy products. This makes it the largest exporter in the world meat and the 2nd largest producer, accounting for 16% of this trade. Considering milk production, Brazil is ranked 3rd in the world market. This production occurs in 48% of areas occupied by rural activities, which are used natural and cultivated pastures. The main forage crops planted in Brazil are Panicum, Brachiaria and Pennisetum, all belonging to the Poaceae family whose center of origin and diversity is in Africa. Plants with symptoms of virus have often been found, mainly in germoplasm banks Embrapa Beef Cattle in Mato Grosso do Sul, and the Embrapa Dairy Cattle in the state of Bahia. Due to lack of knowledge of the etiologic agent, the present study aimed to identify and characterize viruses in forages of Panicum, Brachiaria and Pennisetum. Using high performance platform Illumina sequencing, was identified Johnsongrass mosaic virus. Initially, sequencing was carried out from a Pennisetum line. A second sequencing was done using 5 of Panicum and 5 of Brachiaria lines. Thus, two genomes were obtained from JGMV, one with 9828 nt in length, excluding the poly (A) tail, from Panicum and Brachiaria (JGMV-BR), and the other with a length of 9649 nt, excluding the poly (A) and the 5ˊUTR region, from Pennisetum (JGMV-Penni). The 5ˊRACE technique was used for isolation of the 5ˊUTR of JGMV-BR. The 3ˊUTR for each isolate was also amplified and sequenced. Analysis of the predicted amino acid sequence permitted the deduction of the cleavage sites and the sequences and identifying the conserved motifs within the sequence of each protein. The genome comparisons analysis of each virus revealed identity of the coat protein of 77% (nt) of JGMV-BR and 78% (nt) of JGMV-Penni with JGMV Australian (NC_003606). According to the demarcation criterion for Potyvirus, where the threshold for species differentiation is 76-77% nucleotide identity, the two JGMV are isolated from a strain of the same species. Phylogenetic trees generated using the nucleotide and peptide sequence of the polyprotein revealed that the two Brazilian isolates of JGMV are phylogenetically related to the Australian JGMV, and both are related to Canna yellow streak virus. In addition, several species that infect monocots formed a clade where JGMV groups. From the consensus sequence of the complete genome of JGMV-BR specific primers were synthesized which corresponded to the gene for the coat protein detection JGMV. Furthermore, to evaluate the genetic diversity of JGMV, from 11 lines used in NGS CP gene fragments were cloned and 3 to 5 clones were sequenced for each lines evaluated. The comparison of the nucleotide sequences of the matrix CP compared with the Australian and American isolates ranged 77-82% nucleotide identity. The phylogenetic tree using the nucleotide sequence of CP indicates the presence of at least two strains of JGMV, one circulating US / Australia and other in Brazil. Furthermore, it is possible to observe that some virus isolates were found in more than one line and certain line demonstrated the presence of more than one isolated. Thus, as a result of this work, we performed the first report of JGMV in Brazil.