Expressão transiente de proteínas recombinantes utilizando sistema de planta

• Main Author: Souza, Ana Cláudia de
• Other Authors: Nagata, Tatsuya
• Language: Portuguese
• Published: 2014
• Subjects: Expressão transiente; Proteínas recombinantes
• Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/16859

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. === Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva ([e-mail]) on 2014-11-06T13:36:54Z No. of bitstreams: 1 2014_AnaClaudiadeSouza.pdf: 3213999 bytes, checksum: c330e78f60850f7c3b109e305fe3b27c (MD5) === Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline([e-mail]) on 2014-11-13T13:01:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_AnaClaudiadeSouza.pdf: 3213999 bytes, checksum: c330e78f60850f7c3b109e305fe3b27c (MD5) === Made available in DSpace on 2014-11-13T13:01:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_AnaClaudiadeSouza.pdf: 3213999 bytes, checksum: c330e78f60850f7c3b109e305fe3b27c (MD5) === A utilização de plantas como sistema de produção de proteínas é uma alternativa que está crescendo, e se tornando um importante recurso para a expressão de proteínas de uso terapêutico e de enzimas. Progressos significativos têm sido feitos no desenvolvimento de proteínas recombinantes produzidas em cultura celular e em tecidos de plantas, além de avanços no desenho e implementação de biorreatores. Portanto, o objetivo deste estudo é utilizar sistema de planta para expressão transiente de proteínas recombinantes. Um dos objetivos específicos é expressar a proteína docapsídeo de norovirus (NV CP) para montagem de virus like particles (VLP)utilizando vetor binário e os genes de supressor viral de silenciamento gênico(SG). Outro objetivo específico é produzir o antígeno multiepitopo do vírus dadengue utilizando vetor viral baseado no Cucumber mosaic virus (CMV). Comoobjetivo específico final o vetor baseado no CMV foi testado como vetor deindução de silenciamento gênico (VIGS). Para a expressão de NV CP, asproteínas VP1 e VP2 deste vírus foram clonadas em vetor binário ecoexpressas com a proteína viral supressora de SG, 126 K de Pepper mildmottle virus, em Nicotiana benthamiana. Para visualização, as VLPs forampurificadas de folhas agroinfiltradas e observadas no microscópio eletrônico de transmissão. O uso de vetor binário e gene de supressor viral de SG foi viável para expressão e montagem de NV VLP. Para a expressão da proteínamultiepitopo do vírus da dengue, foi realizada a modificação do vetor viralbaseado no CMV. O RNA 2 do vírus foi modificado para conter os sítios declonagem, e o genoma do vírus foi clonado em vetor binário para que o mesmo pudesse ser utilizado no sistema de agroinfiltração. Os resultados demonstraram que o vetor de expressão baseado no CMV produziu a proteína de interesse com baixo rendimento e que, portanto, deve ser aprimorado. Como objetivo de testar, portanto, a viabilidade deste vetor como VIGS, o mesmo foi modificado novamente para que pudesse realizar a clonagem utilizando sistema de recombinação. Para isso, o gene da fitoeno desaturase (PDS) foi clonado neste vetor, e os resultados demonstraram que o mesmo é infeccioso,porém novos testes serão realizados para aprimorar seu uso como VIGS. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT === The use of plant system as protein expression is an alternative strategy for themass production of therapeutic proteins and enzymes. Significant progresshave been made in producing recombinant proteins in plant cell culture and inplant tissues for the implementation as bioreactors. Therefore, the aim of thisstudy is to use plant system for transient expression of human virus antigen.One of viral proteins expressed was the capsid protein of norovirus (NV-CP) forassembly of virus like particles (VLP) using binary vector and viral suppressorsilencing gene (SG). Another protein was the dengue multi-epitope antigenusing Cucumber mosaic virus (CMV)-based viral vector. CMV-based vector wastested also as the vector induced gene silencing (VIGS) vector. For expressionof NV-CP, the gene of VP1 and VP2 protein were cloned into binary vector andco-expressed with viral protein suppressor (SG), 126K protein of Pepper mildmottle virus in Nicotiana benthamiana. To confirm the VLPs assembly, thepurified VP1 fraction was observed by transmission electron microscopy. Theresults demonstrated that the system using binary vector and SG is viable forthe expression and assembly of NV VLPs. For dengue multiepitopo proteinexpression, the CMV-based vector was modified. CMV RNA 2 segment wasmodified to contain new cloning site and virus genome was cloned into thebinary vector to be used in agroinfiltration system. The results showed thatCMV-based protein expression vector produced the target protein with lowlevels and, therefore, should be improved the system. To evaluate the viabilityof the CMV as a VIGS vector, CMV vector was modified introducing Gatewayrecombination site (Invitrogen). The phytoene desaturase (PDS) gene wascloned into this vector and infiltrated expecting photo-breeching effect resultedas gene knock-down by VIGS. The results demonstrate that it was infectious,but clear knock-down phenotype as photo-breaching was not observed. Thefurther tests are needed to enhance the effect as VIGS.