Desenvolvimento de sistemas para transformação genética de mamona (ricinus communis l.) – as bases para o silenciamento da ricina.

• Main Author: Sousa, Natália Lima de
• Other Authors: Aragão, Francisco José Lima
• Language: Portuguese
• Published: 2014
• Subjects: Ácido ribonucléico; Tecidos vegetais - cultura e meios de cultura; Sementes - toxicologia; Mamona - genética vegetal; Biologia molecular - proteínas
• Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/16266

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2013. === Submitted by Marina Lima ([e-mail]) on 2014-09-12T14:18:16Z No. of bitstreams: 1 2013_NataliaLimadeSousa.pdf: 3031304 bytes, checksum: 04e83c6b880e77c6b74afc2aa6d85b3f (MD5) === Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline([e-mail]) on 2014-09-12T14:38:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_NataliaLimadeSousa.pdf: 3031304 bytes, checksum: 04e83c6b880e77c6b74afc2aa6d85b3f (MD5) === Made available in DSpace on 2014-09-12T14:38:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_NataliaLimadeSousa.pdf: 3031304 bytes, checksum: 04e83c6b880e77c6b74afc2aa6d85b3f (MD5) === A mamona (Ricinus communis L.) é uma oleaginosa de grande importância na indústria por seu óleo apresentar características únicas como alta viscosidade, densidade e estabilidade. A torta de mamona é o subproduto de maior importância da cultura usada principalmente como adubo, com grande potencial de uso como ração animal. No entanto, a presença de ricina (proteína tóxica) no endosperma das sementes da mamona, inviabiliza a utilização em larga escala do seu principal subproduto, sendo necessário um processo de destoxificação da torta. Porém os vários métodos que têm sido desenvolvidos não são viáveis ao nível industrial por serem caros ou ineficientes. Uma alternativa para a redução do teor de ricina nas sementes de mamona é o silenciamento do gene da ricina por RNA interferente, mas os trabalhos de transformação genética de mamona na literatura são escassos e a cultura de tecidos da mamona precisa ser aperfeiçoada. O objetivo deste trabalho foi desenvolver sistemas de transformação genética de mamona e otimizar a cultura de tecidos para produzir plantas transgênicas. Embriões zigóticos maduros da cultivar EBDA-MPA-34 foram cultivados em meio MS suplementado com diferentes citocininas, BAP (0,5 mg.L-1; 2,5 mg.L-1 ou 5,0 mg.L-1) ou TDZ (0,5 mg.L-1; 1,0 mg.L-1 ou 2,5 mg.L-1) e controle (sem fitorregulador). Três explantes por tratamento foram analisados por microscopia eletrônica de varredura após diferentes períodos de cultivo para avaliar a indução de gemas. As cultivares BRS Nordestina, BRS Paraguaçu e EBDA-MPA-34 foram utilizadas para transformação genética usando genes marcadores que conferem tolerância ao IMZ ou higromicina em vetores para bombardeamento ou transformação via agrobactéria, respectivamente. Ambos os vetores contêm uma construção de RNAi onde a região mais conservada do gene da ricina foi clonada de forma repetida e invertida para formar a estrutura de grampo, e está sob domínio do promotor 35SCaMV. Os sistemas de biobalística e A. tumefaciens foram utilizados para transformar embriões zigóticos maduros de mamona previamente induzidos na presença de diferentes citocininas. Foram obtidos seis brotos transformados via biobalística, um da variedade BRS Nordestina confirmado por PCR e os outros cinco da variedade EBDA-MPA-34 expressando gus. Para promover superbrotamento em mamona o melhor fitorregulador foi TDZ e dentre as cultivares testadas a EBDA-MPA-34 foi a melhor opção para transformação genética nas condições testadas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT === Castor bean (Ricinus communis L.) is an oilseed crop of great importance in the industry because of the oil unique features like the high viscosity, density and stability. The castor meal is the most important byproduct of the culture, being used mainly as a fertilizer, with great potential for use as animal feed. However, the presence of ricin (a toxic protein) in the endosperm of the seeds of castor bean, prevents the large scale use of its main by-product, requiring detoxification process of the meal. However the various methods that have been developed are not viable at industrial level because they are expensive or inefficient. An alternative to reducing the amount of ricin in the seeds of castor beans is the ricin gene silencing by RNA interference, but the genetic transformation of castor literature is scarce and the tissue culture of castor needs to be improved. The aim of this study was to develop genetic transformation systems for castor and optimize tissue culture to produce transgenic plants. Mature zygotic embryos of cultivar EBDA-MPA-34 were cultured on MS medium supplemented with different cytokinins, BAP (0.5 mg L-1, 2.5 mg L-1 or 5.0 mg L-1) or TDZ (0.5 mg L-1, 1.0 mg L-1 or 2.5 mg L-1) and control (without plant regulator). Three explants per treatment were analyzed by scanning electron microscopy after different periods of cultivation to assess bud induction. Cultivars BRS Nordestina, BRS Paraguaçu and EBDA-MPA-34 were used for genetic transformation using marker genes that confer resistance to hygromycin or imazapyr in vectors for transformation via Agrobacterium or biolistic, respectively. Both vectors contain a RNAi construct where the most conserved region of the ricin gene has been cloned and inverted repeatedly to form the clamp structure and is under the control of the promoter 35SCaMV. Biolistic and A. tumefaciens systems were used to transform mature zygotic embryos of castor previously induced in the presence of different cytokinins. Six transgenic plants were obtained via biolistic one of the variety BRS Nordestina was positive by PCR and another five of the variety EBDA-MPA-34 expressing gus. To promote the best shoots in castor plant regulator TDZ and is among the cultivars tested EBDA-MPA-34 was the best option for genetic transformation in the conditions tested.