OTIMIZAÇÃO E VALIDAÇÃO DA QUANTIFICAÇÃO DE MALONDIALDEÍDO PLASMÁTICO POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA COM DETECÇÃO VISÍVEL

• Main Author: Grotto, Denise
• Other Authors: Garcia, Solange Cristina
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Santa Maria 2007
• Subjects: MDA; CLAE-VIS; Validação metodológica; Estresse oxidativo; HPLC-VIS; Methodology validation; Oxidative stress; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::FARMACOLOGIA
• Online Access: http://repositorio.ufsm.br/handle/1/5998

The overproduction of reactive oxygen and nitrogen species or the reduction in the antioxidant capacity results in the oxidative stress. The lipid peroxidation involves the oxidative deterioration of polyunsaturated fatty acids and it process is involved in the pathogenesis of diseases such as cancer, diabetes, atherosclerosis and neuro-degenerative diseases. Since it is complex to carry out the free radical quantification directly in vivo, it is necessary to do the measure of their reaction products and the malondialdehyde (MDA) is one of the most known secondary products of the lipid peroxidation used as an indicator of cell membrane injury. The MDA has been measured by its reaction with the thiobarbituric acid (TBA), which produces the MDA-TBA2 complex that can be detected by spectrophotometry method known such thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). However, the major problem in this method is the lack of specificity, once TBA reacts with a variety of compounds, overestimating the real levels of MDA. Thus, methods involving high performance liquid chromatography (HPLC) have been reported, which are specifics and sensitive. In this study, a rapid and reliable method was optimized and validated to quantify plasmatic MDA by HPLC, using visible detection. The analytical parameters evaluated were: linearity, precision, accuracy, recovery, sensibility, robustness, and stability. The optimized method was applied in subjects from a retirement home in Santa Maria. The plasma sample underwent alkaline hydrolysis with NaOH, to a complete release of protein bound to the MDA, followed to acid deproteinization with H3PO4 and derivatization with TBA. To removal of interferents, a sample extraction with n-butanol before the chromatographic injection was carried out. The MDA analysis was performed in a C18 column, integrated with a guard-column. The mobile phase was constituted by KH2PO4 2.5 mM and methanol (50:50), with isocratic elution and detection at 532 nm. The assay was linear from 0.28 to 6.6 μM. The precisions intra and inter-day were obtained with CV% < 4% and < 11%, respectively. The accuracy (bias%) ranged from -4.1 to 2% and the recovery ranged from 95.9 to 102.7%. The limit of detection was 0.05 μM and the limit of quantification was 0.17 μM. For the stability test, it was observed that the MDA standard solutions were stable for, at least, 18 months at -20ºC. The plasma sample was stable for 24h when it was stored at -20ºC, but it was not stable at 4ºC. After alkaline hydrolysis storage at -20ºC, plasmatic MDA was not stable; on the other hand, the sample remained stable for 30 days after TBA reaction storage at -20ºC. After n-butanol extraction storage, the MDA levels were stable for 3 days at -20ºC. The method was applied in plasma samples in healthy subjects from 60 to 80 years. The elderly subjects had MDA plasma levels of 4.45 ± 0.81 μM for women and 4.60 ± 0.95 μM for men, without a significant difference. These levels were considered such as reference values to this age in our laboratory. Thus, the results demonstrated that a simple, rapid and specific technique was optimized and validated. The method showed to be consistent in all analytical parameters and can be used in the routines in clinical laboratories. === A superprodução de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio ou a redução na capacidade antioxidante resulta no estresse oxidativo. A peroxidação lipídica envolve a degradação oxidativa de ácidos graxos polinsaturados e este processo está envolvido na patogênese de doenças como câncer, diabetes, aterosclerose e doenças neurodegenerativas. Já que a quantificação direta de radicais livres in vivo é complexa, torna-se necessário realizar a medida de seus produtos de reação, e o malondialdeído (MDA) é um dos produtos secundários da peroxidação lipídica mais conhecidos utilizado como indicador de injúria da membrana celular. O MDA tem sido medido através de sua reação com o ácido tiobarbitúrico (TBA), o qual produz o complexo MDA-TBA2, detectado por espectrofotometria método conhecido como substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Porém, o maior problema neste método é a falta de especificidade, uma vez que o TBA reage com uma variedade de compostos, superestimando os valores reais de MDA. Assim, métodos envolvendo cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) têm sido descritos, sendo mais específicos e sensíveis. Neste estudo, um método rápido e confiável para quantificar MDA plasmático por CLAE, com detecção visível, foi otimizado e validado. Os parâmetros analíticos avaliados foram: linearidade, precisão, exatidão, recuperação, sensibilidade, robustez e estabilidade. O método otimizado foi aplicado em pessoas de um asilo da cidade de Santa Maria. As amostras de plasma sofreram hidrólise alcalina com NaOH, para uma liberação completa das proteínas ligadas ao MDA, seguida por desproteinização ácida com H3PO4 e derivatização com TBA. Para remoção de interferentes, realizou-se extração da amostra com n-butanol antes da injeção no cromatógrafo. A análise de MDA foi feita em coluna C18, integrada a uma pré-coluna. A fase móvel constituía de KH2PO4 2,5 mM e metanol (50:50), com eluição isocrática e detecção a 532 nm. A análise foi linear de 0,28 a 6,6 μM. As precisões intra e inter-dia foram obtidas com CV% < 4% a < 11%, respectivamente. A exatidão (bias%) variou de -4,1 a 2% e a recuperação variou de 95,9 a 102,7%. O limite de detecção foi de 0,05 μM e o limite de quantificação foi de 0,17μM. Para os testes de estabilidade, observou-se que as soluções padrões de MDA foram estáveis por, no mínimo, 18 meses a -20ºC. O plasma foi estável por 24h quando estocado a -20ºC e instável 4ºC. Armazenado a -20ºC após hidrólise alcalina, o MDA plasmático não permaneceu estável; por outro lado, as amostras continuaram estáveis por 30 dias quando armazenadas após derivatização com TBA, a -20ºC. Depois da extração com n-butanol, os níveis de MDA foram estáveis por 3 dias armazenados a -20ºC. O método foi aplicado em amostras de plasma de indivíduos saudáveis entre 60 e 80 anos. Os idosos apresentaram níveis plasmáticos de MDA de 4,45 ± 0,81 μM para mulheres e 4,60 ± 0,95μM para homens, sem diferença significativa. Estes valores foram considerados como valores de referência para esta faixa etária em nosso laboratório. Assim sendo, os resultados demonstraram que uma técnica simples, rápida e específica foi otimizada e validada. O método mostrou ser confiável em todos os parâmetros analíticos, e pode ser usado em rotinas nos laboratórios clínicos.