Regulação do sistema peptídeos natriuréticos nas células da granulosa e do cumulus na foliculogênese em bovinos

• Main Author: De Cesaro, Matheus Pedrotti
• Other Authors: Gonçalves, Paulo Bayard Dias
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Santa Maria 2017
• Subjects: Divergência folicular; Ovulação; NPPC; NPR-2; EGFr; cANP4-23; Granulosa; Follicular deviation; Ovulation; Granulosa cells; CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::MEDICINA VETERINARIA
• Online Access: http://repositorio.ufsm.br/handle/1/11736

This thesis aims to contribute to the knowledge of the regulation and function of the natriuretic peptide (NP) system during follicular dominance, ovulation, oocyte meiosis resumption and cumulus cells expansion in cattle. In the first study, the NP system was characterized in bovine COC. Moreover, NPPA and NPPC increased cGMP levels in cumulus cells and oocyte after 3 hours of culture, preventing the increase of cAMP in oocyte in the presence of forskolin. In the second study, using in vivo experimental models, none of the three NPs were detected in the granulosa cells during follicular deviation in cattle. However, NPR-3 is highly expressed at the expected time of follicular deviation, and all three NP receptors are expressed in granulosa cells of the dominant follicle. FSH injection maintained the expression of the three NP receptors after follicular deviation in the largest and second largest follicles. However, only NPR-1 mRNA decreased after inhibition of estradiol receptors by intrafollicular injection of fulvestrant. In the granulosa cells of pre ovulatory follicles, only NPPB mRNA was not detected. Nevertheless, after the administration of a GnRH analog, NPPC mRNA expression increased within 3 and 6 hours and NPR-3 mRNA gradually decreased after 3 hours. NPPA and NPR-2 mRNA was not regulated by GnRH, but NPR-1 mRNA increased at 24 hours after GnRH. In the third study, abundance of mRNA for NPR-1, NPR-2 and NPR-3 was not altered by LH and/or AG1478 (EGFr inhibitor) after 6 hours of culture in vitro. Also, LH stimulated NPPC mRNA expression and AG1478 prevented this increase in granulosa cultured in vitro. To confirm the in vitro results, was used an in vivo model and observed that the NPPC mRNA expression increased and NPR-3 mRNA decreased in granulosa cells after 6 hours of GnRH challenge. However, intrafollicular injection of AG1478 prevented the effect of GnRH on NPPC and NPR-3 mRNA expression. In addition, it we obseved that ANP in association with LH stimulated COX2 expression in comparison with LH alone or absence of this gonadotropin. It was observed that the EGFr blockade in vivo did not prevent ovulation in cattle. In the fourth study, it was observed that NPR-3 mRNA expression decreases in bovine cumulus cells after treatment of COCs with FSH or FSH+LH via EGFr. Forskolin, an adenylate cyclase stimulator, also decreased NPR-3 mRNA expression in cumulus cells. Expression of NPR-1 mRNA was very low in bovine cumulus cells and NPR-2 mRNA was not regulated in the proposed treatments. In addition, it was observed that the activation of NPR-3 by a specific agonist (cANP4-23) did not interfere in bovine oocyte nuclear maturation, but it inhibited the complete expansion of cumulus cells FSH+LH-stimulated. Additionally, the association of cANP4-23 with CNP further decreased cumulus cell expansion. === Esta tese tem como objetivo contribuir para o conhecimento da regulação e função do sistema dos peptídeos natriuréticos (NP) durante a dominância folicular, ovulação, retomada da meiose oocitária e expansão das células do cumulus em bovinos. No primeiro estudo, caracterizou-se o sistema NP no CCO de bovino e foi demonstrado que o NPPA e o NPPC aumentam os níveis de cGMP no cumulus e no oócito após 3 horas de cultivo, impedindo o aumento de cAMP no oócito na presença de forskolin. No segundo estudo, utilizando modelos experimentais in vivo, os três NPs não foram detectados nas células da granulosa durante a divergência folicular em bovinos. Contudo, demonstrou-se que o NPR-3 apresenta maior expressão no momento esperado da divergência folicular, sendo que após este momento os três receptores NPs apresentavam alta expressão nas células da granulosa do folículo dominante. A administração de FSH manteve a expressão dos três receptores NPs após a divergência folicular no maior e segundo maior folículo. Porém, somente a expressão do NPR-1 diminui após a inibição dos receptores de estradiol pela injeção intrafolicular de fulvestrant. Nas células da granulosa de folículos pré ovulatórios, somente o NPPB não foi detectado. De modo que, após a administração de um análogo de GnRH, a expressão de NPPC aumentou em 3 e 6 horas e a de NPR-3 gradualmente diminuiu após 3 horas. NPPA e NPR-2 não foram regulados pelo GnRH, e o NPR-1 teve a expressão aumentada somente 24 horas após o GnRH. No terceiro estudo, a abundância de mRNA para NPR-1, NPR-2 e NPR- 3 nas células da granulosa não foi alterada por LH e/ou por AG1478 (inibidor do EGFr) após 6 horas de cultivo in vitro. Também em cultivo in vitro de células da granulosa, o LH estimulou a expressão de NPPC, sendo que o AG1478 impediu este aumento. Como forma de comprovar esses resultados in vitro, utilizamos um modelo in vivo e observamos que a expressão do NPPC aumentou e a do NPR-3 diminuiu após 6 horas do desafio com GnRH, nas células da granulosa. De maneira que, a injeção intrafolicular de AG1478 preveniu o efeito do GnRH sobre a expressão do NPPC e NPR-3. Além disso, foi demonstrado que o ANP em associação com o LH estimulou a expressão de COX2 em comparação com LH isoladamente ou ausência desta gonadotrofina. Também foi demonstrado que o bloqueio do EGFr in vivo não foi suficiente para bloquear a ovulação em bovinos. No quarto estudo, foi observado que a expressão do NPR-3 diminui nas células do cumulus pelo tratamento dos CCOs com FSH ou FSH+LH via EGFr em bovinos. Forskolin (estimulador adenilato ciclase) também induziu a diminuição da expressão do NPR-3. A expressão do NPR-1 foi muito baixa no cumulus de bovino e o NPR-2 não apresentou regulação nos tratamentos propostos. Além disso, foi observado que a ativação do NPR-3 por um agonista específico (cANP4-23) não interferiu na maturação nuclear oocitária em bovinos, porém, inibiu a completa expansão das células do cumulus estimulada por FSH+LH. De maneira que, a associação do cANP4-23 com CNP potencializou a inibição da expansão das células do cumulus.