O potencial das células intestinais como fonte de células progenitoras pancreáticas

• Main Author: Glanzner, Werner Giehl
• Other Authors: Gonçalves, Paulo Bayard Dias
• Format: Others
• Language: Portuguese
• Published: Universidade Federal de Santa Maria 2012
• Subjects: Insulina; Suíno; Expressão gênica; Cultivo celular; Insulin; Porcine; Gene expression; Cell culture; CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::MEDICINA VETERINARIA
• Online Access: http://repositorio.ufsm.br/handle/1/10121

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico === The objective of the present study was to establish a primary culture of intestinal cells and to characterize the mRNA expression profile of genes related to pancreatic formation, development and insulin metabolism. The mRNA expression of pancreatic-related genes was evaluated in intestinal tissue and isolated cells from newborn piglet by qRT-PCR. The tissue and isolated cells before and after culture from the first two passages were evaluated for Pdx1 (Pancreatic and duodenal homeobox), Ngn3 (Neurogin3), NeuroD1 (Neurogenic differentiation 1), PC1/3 (Prohormone convertase 1/3), PC2 (Prohormone convertase 2) and insulin (INS) gene expression. The intestinal tissue and passage 2 of cultured cells were evaluated for the presence of insulin by immunofluorescence. In the first experiment, cells were cultured in RPMI medium plus EGF, penicillin, amphotericin B, and insulin (10 μg/ml). The Ngn3, PC1/3 and PC2 expression did not differ during cell isolation process and culture passages, while for genes Pdx1, INS and NeuroD1 the expression decreased in cultured cells. In the second experiment, a primary cell culture of porcine newborn intestinal cells were performed using the same medium describe above but without insulin (control group) or with glucose (25 mM) and without insulin (treatment group). The objective of this experiment was to evaluate the mRNA expression of pancreatic-related genes in response to glucose. Independently of the presence of glucose, the expression of all studied genes decreased at passage 1 and raised (to the same levels found in intestine) or even higher (NeuroD1) at passage 2 of cultured cells, except for Pdx1. The Pdx1 mRNA expression observed in intestinal tissue was maintained through first cell passage, but decreased at passage 2. The intestinal tissue and cells cultured with or without glucose from the second passage did not reveal any insulin-producing cell by immunofluorescence. Our results let us to conclude that newborn duodenal tissue had cells that express mRNA pancreatic markers; however, these cells were not able to produce insulin. The results of this study allowed us to infer that newborn piglet duodenal cells have potential to be transdifferentiated in insulin producing cells for cell therapy of type 1 diabetes mellitus. === O objetivo do presente trabalho foi estabelecer um cultivo primário de células intestinais de suínos para a caracterização celular quanto a expressão de RNAm de genes relacionados á formação e desenvolvimento pancreático e ao metabolismo da insulina. O tecido intestinal e as células isoladas de leitões neonatos foram avaliados quanto a expressão de RNAm dos genes pancreáticos por qRT-PCR. O tecido e as células isoladas antes e depois do cultivo, nas duas primeiras passagens, foram avaliados para os genes Pdx1 (Pancreatic and duodenal homeobox), Ngn3 (Neurogin3), NeuroD1 (Neurogin differentiation 1), PC1/3 (Prohormone convertase 1/3), PC2 (Prohormone convertase 2) e o gene da insulina (INS). O intestino e a passagem 2 das células cultivadas foram avaliadas quanto a presença de insulina por imunofluorescência. No primeiro experimento, as células intestinais foram cultivadas em meio contendo RPMI, EGF, penicilina, anfotericina B e insulina (10μg/ml). Para os genes Ngn3, PC1/3 e PC2 a expressão de RNAm não diferiu durante o processo de obtenção das células nem durante as passagens, enquanto que para os genes Pdx1, INS e NeuroD1 a expressão diminuiu nas células cultivadas. No segundo experimento, foi realizado um cultivo primário de células intestinais de suínos neonatos, utilizando o meio básico descrito no primeiro experimento, mas sem insulina (grupo controle) ou com 25 mM de glicose e sem insulina (grupo tratamento). Esse experimento foi realizado com o objetivo de avaliar a expressão desses genes em resposta á ausência da insulina ou presença de glicose no cultivo. Independentemente da adição de glicose, houve uma diminuição da expressão de todos os genes estudados ao longo da primeira passagem e um aumento (retornando aos níveis iniciais encontrados no intestino), ou até superiores (NeuroD1) em células da segunda passagem, com exceção do Pdx1. A quantidade de mRNA para Pdx1 observada no tecido intestinal se manteve nas células isoladas e na primeira passagem, independente da presença de glicose, e decresceu nas células da segunda passagem. Anticorpos para insulina não detectaram a presença desta proteína no tecido intestinal, bem como nas células cultivadas com adição de glicose e do grupo controle. Com base nesses resultados, pode-se inferir que as células intestinais duodenais de suínos neonatos possuem um caráter de célula progenitora pancreática, em função do padrão de expressão gênica, porém não são capazes de produzir a proteína insulina. No entanto, observando os dados de expressão de RNAm é possível sugerir que essas células podem ser mais facilmente diferenciadas e consequentemente usadas em estudos de terapia celular para diabetes mellitus tipo 1.