| Summary: | Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico === The objective of the present study was to establish a primary culture of intestinal cells
and to characterize the mRNA expression profile of genes related to pancreatic formation,
development and insulin metabolism. The mRNA expression of pancreatic-related genes was
evaluated in intestinal tissue and isolated cells from newborn piglet by qRT-PCR. The tissue
and isolated cells before and after culture from the first two passages were evaluated for Pdx1
(Pancreatic and duodenal homeobox), Ngn3 (Neurogin3), NeuroD1 (Neurogenic
differentiation 1), PC1/3 (Prohormone convertase 1/3), PC2 (Prohormone convertase 2) and
insulin (INS) gene expression. The intestinal tissue and passage 2 of cultured cells were
evaluated for the presence of insulin by immunofluorescence. In the first experiment, cells
were cultured in RPMI medium plus EGF, penicillin, amphotericin B, and insulin (10 μg/ml).
The Ngn3, PC1/3 and PC2 expression did not differ during cell isolation process and culture
passages, while for genes Pdx1, INS and NeuroD1 the expression decreased in cultured cells.
In the second experiment, a primary cell culture of porcine newborn intestinal cells were
performed using the same medium describe above but without insulin (control group) or with
glucose (25 mM) and without insulin (treatment group). The objective of this experiment was
to evaluate the mRNA expression of pancreatic-related genes in response to glucose.
Independently of the presence of glucose, the expression of all studied genes decreased at
passage 1 and raised (to the same levels found in intestine) or even higher (NeuroD1) at
passage 2 of cultured cells, except for Pdx1. The Pdx1 mRNA expression observed in
intestinal tissue was maintained through first cell passage, but decreased at passage 2. The
intestinal tissue and cells cultured with or without glucose from the second passage did not
reveal any insulin-producing cell by immunofluorescence. Our results let us to conclude that
newborn duodenal tissue had cells that express mRNA pancreatic markers; however, these
cells were not able to produce insulin. The results of this study allowed us to infer that
newborn piglet duodenal cells have potential to be transdifferentiated in insulin producing
cells for cell therapy of type 1 diabetes mellitus. === O objetivo do presente trabalho foi estabelecer um cultivo primário de células
intestinais de suínos para a caracterização celular quanto a expressão de RNAm de genes
relacionados á formação e desenvolvimento pancreático e ao metabolismo da insulina. O
tecido intestinal e as células isoladas de leitões neonatos foram avaliados quanto a expressão
de RNAm dos genes pancreáticos por qRT-PCR. O tecido e as células isoladas antes e depois
do cultivo, nas duas primeiras passagens, foram avaliados para os genes Pdx1 (Pancreatic and
duodenal homeobox), Ngn3 (Neurogin3), NeuroD1 (Neurogin differentiation 1), PC1/3
(Prohormone convertase 1/3), PC2 (Prohormone convertase 2) e o gene da insulina (INS). O
intestino e a passagem 2 das células cultivadas foram avaliadas quanto a presença de insulina
por imunofluorescência. No primeiro experimento, as células intestinais foram cultivadas em
meio contendo RPMI, EGF, penicilina, anfotericina B e insulina (10μg/ml). Para os genes
Ngn3, PC1/3 e PC2 a expressão de RNAm não diferiu durante o processo de obtenção das
células nem durante as passagens, enquanto que para os genes Pdx1, INS e NeuroD1 a
expressão diminuiu nas células cultivadas. No segundo experimento, foi realizado um cultivo
primário de células intestinais de suínos neonatos, utilizando o meio básico descrito no
primeiro experimento, mas sem insulina (grupo controle) ou com 25 mM de glicose e sem
insulina (grupo tratamento). Esse experimento foi realizado com o objetivo de avaliar a
expressão desses genes em resposta á ausência da insulina ou presença de glicose no cultivo.
Independentemente da adição de glicose, houve uma diminuição da expressão de todos os
genes estudados ao longo da primeira passagem e um aumento (retornando aos níveis iniciais
encontrados no intestino), ou até superiores (NeuroD1) em células da segunda passagem, com
exceção do Pdx1. A quantidade de mRNA para Pdx1 observada no tecido intestinal se
manteve nas células isoladas e na primeira passagem, independente da presença de glicose, e
decresceu nas células da segunda passagem. Anticorpos para insulina não detectaram a
presença desta proteína no tecido intestinal, bem como nas células cultivadas com adição de
glicose e do grupo controle. Com base nesses resultados, pode-se inferir que as células
intestinais duodenais de suínos neonatos possuem um caráter de célula progenitora
pancreática, em função do padrão de expressão gênica, porém não são capazes de produzir a
proteína insulina. No entanto, observando os dados de expressão de RNAm é possível sugerir
que essas células podem ser mais facilmente diferenciadas e consequentemente usadas em
estudos de terapia celular para diabetes mellitus tipo 1.
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