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Previous issue date: 2016-02-23 === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) === The objective of this project is the developing of an immunosensor for detection of
a protein biomarker contained in peripheral blood, in this case the ADAM10, that
belong to the family of ADAM (A disintegrin and metalloprotease) in order to early
diagnosis of Alzheimer's disease (AD) and check the progression of the dementia.
The ADAM10 are α-secretase proteins that are involved in the cleavage of the
amyloid precursor protein, which has correlation with AD. For this, disposable
electrochemical cell based on an array of carbon electrodes was developed using
screen-printing technique, which was subsequently coupled to a microfluidic
system, in order to reduce the time for analysis as well as the sample consumption
for the biomarker detection. In this way, specific monoclonal antibodies for
ADAM10 were immobilized from covalent bonds on the surface of the modified
electrodes. The electrode was modified by deposition of a polymer followed by a
layer of gold nanoparticles by Layer-by-Layer technique. In addition, magnetic
particles (MPs) was used decorated with electrochemical markers and specific
antibodies for capture of biomarkers in synthetic and real samples. Finally, the
electrodes were exposed to the bioconjugate formed by the analyte bounded to MPs
following by the detection step, which consisted of the electrochemical response of
the enzyme marker present in the MP. As a result, good reproducibility and
repeatability among the disposable electrodes were obtained. Parameters such as
biomarker capture time and flow rate of the carrier solution was evaluated, in order
to ensure the best response for the developed immunosensor. The time of 30
minutes was established as the most efficient for capturing the biomarker, while the
flow rate was 100 μL min-1. Once define the best conditions, the analytical curve was developed in calf serum, getting a detection limit of 5.56 fg mL-1, a sensibility
of 1.47 nA mL fg [ADAM10]-1 and linear range of 5.56 fg mL-1 on 1,389 pg ml-1.
The developed system was applied to the detection of ADAM10 present in real
samples of healthy elderly and holders of AD, getting a satisfactory result when
compared to that obtained by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). The
proposed method allows to evaluate the expression and progression of the disease
in elderly patients. For control patients, it was obtained a lower concentration of
ADAM10 when compared to concentrations found in the different stages of AD.
Thus, the developed method can bring relevant contributions to an accurate and
early diagnosis of AD. === O presente projeto de pesquisa teve como objetivo o desenvolvimento de um
imunossensor para a determinação de um biomarcador proteico, contido no sangue
periférico, no caso a ADAM10, pertencente à família das ADAMs (A disintegrin
and metalloprotease), a fim de diagnosticar precocemente a doença de Alzheimer
(DA) e verificar a progressão do quadro demencial. As ADAM10 são proteínas α-
secretases envolvidas na clivagem da proteína precursora do amilóide, que possuem
correlação com a DA. Para isto, foram desenvolvidas células eletroquímicas
descartáveis baseadas em um arranjo de eletrodos de carbono obtidos por meio da
técnica de serigrafia, que posteriormente foram acoplados a um sistema
microfluídico, a fim de diminuir o tempo de análise, e reduzir o consumo de
amostra na detecção do biomarcador. Para tanto, anticorpos monoclonais
específicos para o analito foram imobilizados a partir de ligações covalentes sobre
a superfície dos eletrodos já modificados. Essa modificação consistiu na deposição
do polímero cloreto de poli(dialildimetil-amônio) seguida de uma camada de
nanopartículas de ouro por meio da técnica layer-by-layer. Além disso, fez-se uso
de partículas magnéticas (PMs) decoradas com marcadores eletroquímicos e
anticorpos específicos para captura dos biomarcadores nas amostras sintéticas e
reais. Por fim, os eletrodos foram expostos ao bioconjugado formado pelo analito
ligado as PMs, e assim realizada a etapa de detecção, que consistiu na resposta
eletroquímica dada pelo marcador enzimático presente na PM. Como resultado
observou-se boa reprodutibilidade e repetitividade entre os eletrodos descartáveis
construídos. Parâmetros tais como tempo de captura do biomarcador no eletrodo e
vazão da solução carreadora foram avaliados, a fim de garantir uma melhor eficiência do imunossensor desenvolvido. O tempo de 30 minutos foi estabelecido como o mais eficiente para a captura do biomarcador, enquanto a vazão foi de 100
μL min-1. Uma vez obtidas as melhores condições a curva analítica, foi
desenvolvida em soro de bezerro, obtendo-se um limite de detecção de 5,56 fg mL-
1, sensibilidade de 1,47 nA mL fg [ADAM10]-1 e intervalo linear de 5,56 fg mL-1 a
1,389 pg mL-1. O sistema desenvolvido foi aplicado na detecção de ADAM10
presente em amostras reais de idosos saudáveis e portadores da DA, obtendo um
resultado bastante satisfatório quando comparado àquele obtido pelo método
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). O método proposto permitiu avaliar
a expressão da doença nos pacientes idosos bem como a progressão da mesma,
sendo que para pacientes controle foi obtida uma menor concentração de ADAM10
quando comparada as concentrações encontradas nos diferentes estágios da DA.
Desta forma, o método desenvolvido pode trazer contribuições relevantes para um
diagnóstico preciso e precoce da DA.
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