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Previous issue date: 2016-06-15 === Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) === Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) === Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) === Aspergillus fumigatus is an opportunistic pathogenic filamentous fungus, and the
causative agent of aspergillosis, including the invasive pulmonary aspergillosis in
immunocompromised individuals, most lethal form of the disease. As in all
eukaryotes, the plasma membrane of A. fumigatus is composed of sterols, glycolipids
and sphingolipids. The sphingolipids molecules are structural elements that
participate in the regulation of the actin cytoskeleton endocytosis, and cell growth. In
Saccharomyces cerevisiae, the sphingolipid synthesis is regulated by proteins such
as the "AGC kinases" known as Ypk1p and Ypk2p that inactivate Orm1p and Orm2p,
which are inhibitory proteins of the serine palmitoyltransferase (SPT) enzyme, the
first enzyme that participates in biosynthetic pathway of sphingolipids. Thus, Ypk1/2p
are responsible for stimulating the production of sphingolipids in response to several
cellular stress factors, such as cell wall stress and heat stress. Here, we aimed to
expand the study of sphingolipid biosynthesis in A. fumigatus by functional
characterization of the ypkAYPK1 gene by establishing its role in the regulation of
sphingolipid synthesis and in the maintenance of cell integrity. To accomplish this
goal, one null mutant strain ΔypkAypk1 and a conditional mutant strain niiA::ypkA of A.
fumigatus were obtained. The mutant strains were characterized by phenotypic tests
aimed at understanding the role of this gene in sphingolipid synthesis, virulence and
pathogenicity of this fungus. Subsequently real time RT-PCR experiments were
performed to quantify the expression of this gene in conditions of heat stress. The
results indicated that deletion of the gene ypkA promotes changes in the
development of the fungus, which presents severe defects in the vegetative growth
and absence of conidia. In addition, the conditional mutant shows increased
sensitivity to lipid synthesis inhibitory drugs. The results also indicate that there is no
interaction between genetic ypkA and pathway genes of the cell wall. Thus, we
propose that protein kinase YpkA in A. fumigatus is related to vegetative growth and
participates in the sphingolipid biosynthesis in A. fumigatus, contributing to the
development and integrity of the fungal cell. === Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso patogênico oportunista, e o agente
etiológico da aspergilose, que em imunocomprometidos pode vir a ocasionar a forma
mais letal da doença, a aspergilose pulmonar invasiva. Como em todos os
eucariotos, a membrana plasmática de A. fumigatus é composta por esteróis,
glicolipídios e esfingolipídios. As moléculas de esfingolipídios são elementos
estruturais que participam da regulação da endocitose, do citoesqueleto de actina e
do crescimento celular. Em Saccharomyces cerevisiae, a síntese de esfingolipídios é
regulada pelas proteínas do tipo “AGC quinases” conhecidas como Ypk1p e Ypk2p,
que inativam Orm1p e Orm2p, as quais são proteínas inibidoras da enzima serina
palmitoil-transferase (SPT), a primeira enzima que participa da via de biossíntese
dos esfingolipídios. Dessa forma Ypk1/2p são responsáveis por estimular a
produção de esfingolipídios na membrana plasmática em resposta a diversos fatores
de estresse celular, como por exemplo o estresse de parede celular, estresse
térmico entre outros. Diante disso, este trabalho teve como objetivo ampliar o estudo
da biossíntese de esfingolipídios em A. fumigatus através da caracterização
funcional do gene ypkAYPK1, de forma a estabelecer sua função na regulação da
síntese de esfingolipídios e na manutenção da integridade celular. Para cumprir esse
objetivo, uma linhagem mutante nulo ΔypkAypk1 e uma linhagem mutante condicional
niiA::ypkA em A. fumigatus foram obtidas. As linhagens mutantes foram
caracterizadas através de ensaios fenotípicos visando a compreensão do papel
desse gene na síntese de esfingolipídios, na virulência e patogenicidade desse
fungo. Posteriormente, foram realizados experimentos de RT-PCR em tempo real
para a quantificação da expressão desse gene em condições de estresse térmico.
Os resultados indicaram que a deleção do gene ypkA promove alterações no
desenvolvimento vegetativo do fungo, o qual cresce na forma de colônias pequenas
as quais não formam conídios. Ainda, o mutante condicional, quando reprimido,
apresenta sensibilidade a drogas inibidoras da síntese de lipídeos e esfingolipídios.
Os resultados indicam também que não há interação genética entre ypkA e os genes
da via da integridade da parede celular. Assim, podemos propor que a proteína
quinase YpkA de A. fumigatus está relacionada com o crescimento vegetativo e
participa da biossíntese de esfingolipídios em A. fumigatus, contribuindo com o
desenvolvimento e integridade da célula fúngica.
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